Piante come bioreattori per la produzione di vaccini
eduli
Le piante si sono rivelate nei secoli come organismi estremamente
duttili, capaci di adattarsi alle necessità dell’uomo,
sia per scopi agricoli che ornamentali. Circa vent’anni
fa, con i primi studi sulla tecnica del DNA ricombinante, è
anche stata scoperta la possibilità di introdurre e far
esprimere in un tessuto vegetale geni non solo derivanti da altre
specie vegetali, ma anche di origine batterica o animale.
Questa scoperta ha aperto nuovi orizzonti per l’enorme numero
di applicazioni che si potevano proporre. I primi studi naturalmente
sono stati rivolti al miglioramento delle piante stesse, per la
loro difesa contro organismi patogeni ed infestanti.
A questo scopo sono stati introdotti geni di resistenza di origine
batterica, fungina o isolati da altre piante fornite per natura
della difesa desiderata. Da qui ad immaginare che fosse possibile
far produrre alla pianta altri generi di proteine, non necessariamente
a suo vantaggio, il passo è stato breve. In particolare,
grande interesse ha suscitato la possibilità di produrre
molecole ad uso sanitario, come antigeni per la produzione di
vaccini, anticorpi o proteine a funzione farmacologica.
Come produrre dei vaccini di tipo innovativo
Le tre principali categorie di vaccini oggi disponibili sono costituite
da:
vaccini attenuati, costituiti da microrganismi patogeni di cui
sia stata ridotta la virulenza;
vaccini inattivati, costituiti da microrganismi la cui virulenza
sia stata neutralizzata;
vaccini di subunità, costituiti da elementi purificati
di microrganismi, il vaccino in questo caso conterrà solo
una parte (costituita da una o più proteine) dell’organismo
originale, ma sufficiente a scatenare una reazione immunitaria;
vaccini ricombinanti. Quest’ultima categoria si basa sull’identificazione
di molecole ad attività antigenica, capaci di indurre una
risposta immunitaria, sull’isolamento del gene corrispondente
e sulla produzione del vaccino in un sistema di espressione eterologo,
fino ad oggi un microrganismo o un tessuto animale.
Il miglior sistema di espressione sarà naturalmente quello
in grado di garantire la sicurezza del prodotto finale, un’attività
biologica ottimale ed un costo di produzione contenuto. L’espressione
di antigeni in cellule di mammifero ha il vantaggio di dare prodotti
idonei, ma la procedura è costosa e non esente da pericoli
(possibile presenza di agenti patogeni derivanti dall’animale
utilizzato). L’utilizzo di microrganismi come sistema di
espressione permette una produzione su scala più ampia
ma presenta anche limitazioni quando siano necessarie modificazioni
secondarie, tipiche delle cellule eucariotiche (ad esempio, glicosilazione)
o un particolare ripiegamento (folding) della proteina prodotta.
Recentemente è stato proposto un nuovo sistema di espressione,
basato sull’integrazione degli opportuni geni in piante
superiori. Questo offrirebbe vantaggi considerevoli per la sicurezza
del prodotto, grazie all’assenza di quelle contaminazioni
con patogeni animali o tossine che potrebbero essere presenti
in vaccini espressi in cellule animali o batteriche. Data la facilità
con cui le piante producono un’abbondante biomassa su scala
agro-industriale, l’approccio porterebbe ad una notevole
diminuzione dei costi. Infine i vaccini fatti in pianta sarebbero
indipendenti dalla “catena del freddo” oggi necessaria
per la conservazione e per la distribuzione e potrebbero permettere
la somministrazione orale, come alternativa alla via dell’iniezione
parenterale (Daniell et al., 2001; Sala et al., 2003).
La possibilità di somministrazione di vaccini eduli espressi
in pianta ha suscitato grande interesse anche in campo veterinario,
in particolare, per agli animali allevati per uso alimentare,
in considerazione delle implicazioni sociali ed economiche legate
alla loro salute. La possibilità di fornire direttamente
a questi animali delle sostanze ad attività farmacologica
sotto forma di cibo, semplificherebbe enormemente le pratiche
di somministrazione. Quando anche il vaccino debba essere dosato
in modo preciso, le piante transgeniche esprimenti l’antigene
possono essere facilmente disidratate, il principio attivo dosato
e quindi somministrato dopo essere stato mescolato alla razione
giornaliera. Questo porterebbe ad una considerevole riduzione
nei costi ed eviterebbe lo stress indotto negli animali dalla
pratica iniettiva.
Le ricerche su vaccini prodotti in pianta si sono sviluppate negli
ultimi 10 anni in molte direzioni. Di seguito riportiamo alcuni
esempi dei primi risultati ottenuti con questa tecnologia: espressione
dell’antigene per l’epatite B in tabacco e lattuga
(Mason et al.,1992; Eheani et al., 1997), dell’antigene
per la rabbia nel pomodoro (McGarvey et al., 1995), di un antigene
per il colera in tabacco e patata (Arakawa et al., 1997) e di
un antigene per il citomegalovirus in tabacco (Tackaberry et al.
1999). Esperimenti condotti su animali da laboratorio hanno dimostrato
la capacità di questi vaccini di stimolare il sistema immunitario
inducendo la sintesi di anticorpi contro l’epatite B (Thanavakam
et al., 1995), il Norwalk virus (Mason et al., 1996) ed enteriti
batteriche (Haq et al., 1995). In una prima sperimentazione su
volontari umani, il vaccino costituito dalla subunità B
dell’enterotossina di E. coli, espressa in tabacco, ha dato
risposta immunitaria, sia a livello mucosale che sistemico, in
individui trattati per via orale con un opportuno dosaggio di
patata transgenica (Tacket et al., 1998). L’ottenimento
di un’immunità mucosale è uno dei punti a
favore dei vaccini eduli. Molti agenti patogeni penetrano nel
corpo attraverso le mucose. Le prime difese sono quindi quelle
presenti sulle mucose stesse che rivestono le vie respiratorie,
il tratto digestivo e quello uro-genitale. Per migliorare ulteriormente
la capacità dei vaccini espressi in pianta di evocare una
risposta mucosale, è stata studiata la possibilità
di costruire geni chimerici esprimenti forme detossificate della
tossina del colera (CT) e dell’enterotossina termolabile
di E. coli (LT), legate come adiuvanti a proteine antigeniche
(Di Tommaso et al., 1996; Kong et al., 2001). Inoltre, la cellula
vegetale è circondata da una parete cellulosica che la
protegge dall’azione dei succhi gastrici. Negli animali
non ruminanti, i tessuti vegetali vengono trasportati direttamente
nel lume intestinale dove vengono lentamente lisi e possono agire
come un sistema naturale a lento rilascio.
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Metodi di trasformazione vegetale
Le tecniche per la trasformazione di piante sono fondamentalmente
due: il metodo basato sull’uso di Agrobacterium ed il metodo
biolistico. Il primo si basa sulla proprietà dei patogeni
vegetali A. tumefaciens e A. rhizogenes, di integrare il proprio
DNA (T-DNA) nel genoma nucleare delle cellule infettate (de la
Riva et al., 1988). L’introduzione di geni esogeni nel T-DNA
opportunamente modificato delle cellule di Agrobacterium, e la
successiva infezione di un tessuto vegetale, portano all’integrazione
stabile del gene di interesse nel genoma della pianta e alla produzione
di una proteina transgenica (Figura 1).
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Figura
1
Infezione di tessuto fogliare con Agrobacterium tumefaciens.
A) Durante l'infezione, il gene di interesse
viene trasferito dalla cellula batterica al nucleo della cellula
vegetale, tramite il T-DNA batterico che ha la capacità
di excidersi dal plasmide vettore e ricombinarsi con il DNA
vegetale inserendosi in un cromosoma.
B) Le cellule infettate da Agrobacterium
iniziano a proliferare formando il così detto “callo”.
C) Alcune cellule del callo iniziano a differenziarsi
e danno origine ad un germoglio.
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L’applicabilità della trasformazione mediata da
Agrobacterium, dapprima limitata al tabacco e a poche altre specie,
bersagli naturale dell’infezione, è ora ampliata
alla maggior parte delle specie vegetali di interesse agronomico,
comprese graminacee e leguminose (Lee et al., 2001; Chikwamba
et al., 2002). Questo apre interessanti prospettive per lo sviluppo
di vaccini eduli per uso sia umano che veterinario.
Il secondo approccio si basa sulla tecnica del bombardamento con
microproiettili (Taylor e Fauquet, 2002). Sequenze selezionate
di DNA vengono fatte precipitare su microparticelle metalliche
e sparate a velocità accelerata con un apposito strumento
(particle gun) contro il tessuto vegetale. Le microparticelle
penetrano la parete e rilasciano il DNA esogeno all’interno
della cellula, dove, attraverso meccanismi non ancora completamente
chiariti, si integrerà nel genoma nucleare. Nelle cellule
vegetali sono presenti degli organelli citoplasmatici, i cloroplasti,
contenenti la clorofilla, noti in generale per la loro funzione
fotosintetica. In questi organelli che, come i mitocondri, si
pensa derivino da antichi predecessori batterici, entrati come
simbionti in una cellula più grande, è presente
un corredo genico indipendente, ma con caratteristiche appunto
da cellula procariote. È possibile, con il metodo biolistico,
“sparare” particelle di DNA opportunamente elaborate
che, arrivando all’interno del cloroplasto, si integrino
nel suo genoma. La trasformazione del cloroplasto rappresenta
un’interessante alternativa alla trasformazione nucleare
(Maliga, 2002; Daniell et al., 2002). Infatti, secondo alcuni
dati pubblicati sulla trasformazione di tabacco per l’espressione
della tossina insetticida di Bacillus thuringiensis (BT), l’introduzione
di geni esogeni nel genoma di cloroplasto ha portato ad un accumulo
di proteine ricombinanti attive pari al 47% delle proteine solubili
totali (De cosa et al, 2001) Questo tipo di trasformazione offre
il vantaggio di avere più copie del transgene per cellula.
Inoltre, diversamente da quanto avviene nel nucleo, la trasformazione
del cloroplasto si basa sull’inserzione del gene esogeno
per ricombinazione omologa. È possibile quindi indirizzare
l’inserimento del transgene in un punto preciso del cromosoma
plastidiale. Questo porta ad evitare effetti posizionali, negativi
per la crescita della pianta, che spesso si verificano nelle trasformazioni
nucleari, in seguito all’inserimento di un gene in un punto
casuale del genoma nucleare.
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Figure 2
Dischetto fogliare infettato con Agrobacterium tumefaciens,
allo stadio di formazione del callo. |
Sino ad ora tuttavia, l’ingegneria genetica del cloroplasto
è stata attuata solo in tabacco e parzialmente in patata.
Si può auspicare che col tempo questa tecnologia venga
estesa ad altre specie di maggiore interesse per la produzione
di vaccini eduli, come ad esempio il mais, la lattuga o il trifoglio.
Nei nostri laboratori, presso il Dipartimento di Biologia dell’Università
degli Studi di Milano, è attualmente allo studio la possibilità
di esprimere in pianta diverse proteine ad attività antigenica,
sia per uso umano che veterinario. Nell’ambito di una collaborazione
con l’Istituto Pasteur di Parigi, un poliepitopo (molecola
costituita da un insieme di frammenti peptidici ad attività
immunostimolatoria) con caratteristiche antigeniche contro il
melanoma umano è stato espresso in foglie di tabacco ed
è al momento in fase di prima sperimentazione per valutarne
il livello di immunogenicità.
In uno stadio più iniziale è la ricerca mirata alla
produzione di vaccini veterinari. Questa ricerca, svolta in collaborazione
con diversi Istituti della Facoltà di Medicina Veterinaria
dell’Università di Milano, vuole prima di tutto verificare
le potenzialità del nuovo sistema di produzione di vaccini,
attraverso un confronto passo per passo tra vaccini “tradizionali”
e vaccini espressi in pianta.
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Figure 3
Dischetto fogliare infettato, in fase di rigenerazione; si
nota la formazione di un germoglio. |
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Le fasi della ricerca
Per raggiungere questo scopo è stato necessario individuare
patologie per cui esistessero già dei vaccini commerciali,
basati su una proteina (l’antigene) di provata capacità
immunogenica. Della proteina è necessario conoscere la
struttura, la sequenza aminoacidica, ma soprattutto la sequenza
nucleotidica del gene da cui essa deriva. Questi dati devono essere
accuratamente valutati perché, pur essendo il DNA di ogni
essere vivente costituito da soli 4 nucleotidi, e pur essendo
il codice genetico pressoché universale, ogni organismo
ha delle sue “preferenze” e delle caratteristiche
specifiche nei sistemi di traduzione e maturazione delle proteine.
Ad esempio, alcuni aminoacidi sono codificati da più di
una tripletta di DNA, ma ogni organismo utilizza preferenzialmente
alcune triplette rispetto ad altre; è necessario quindi
che l’organismo ospite presenti tutte le triplette necessarie
per la traduzione della proteina. Altri problemi si potrebbero
avere con proteine che necessitino di una glicosilazione, in quanto
la struttura chimica dei gruppi saccaridici, aggiunti dalle piante
in fase di maturazione di una proteina, può essere leggermente
diversa da quella degli animali e questo potrebbe causare la formazione
di un anticorpo non perfettamente aderente alle richieste. Tutto
ciò va saputo a priori per poter modificare opportunamente
il gene da introdurre nella pianta ospite, ad esempio con una
mutazione sito-specifica.
Attualmente lo studio si sta sviluppando su diverse linee, mirato
a trasformare piante per la difesa contro malattie causate da
differenti organismi e con organismi bersaglio altrettanto lontani.
Come esempi citiamo la filariosi animale, ma anche umana, causata
da un verme nematode, una particolare forma di enteropatia bovina,
causata dal batterio Escherichia coli ed una malattia degenerativa
dell’apparato respiratorio e riproduttore del cavallo, causato
da un herpes virus. Per ognuna di queste patologie è già
stata individuata ed ampiamente studiata una proteina che, riprodotta
con sistemi tradizionali, può essere utilizzata come vaccino.
Nella prima fase della ricerca, abbiamo scelto di utilizzare come
sistema vegetale il tabacco, in quanto è il sistema più
noto e meglio studiato, per ridurre al minimo le variabili di
cui tenere conto. Naturalmente in questo caso, la sperimentazione
sugli animali dovrà essere fatta utilizzando degli estratti
proteici, privi degli alcaloidi normalmente presenti nel succo
cellulare della pianta. In una fase successiva si prevede la trasformazione
di una pianta edule, ad esempio il riso.
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Figure 4
Dischetto fogliare infettato, in fase di rigenerazione avanzata;
si notano le foglioline dei germogli in espansione. |
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I geni, se adeguati per l’espressione nell’ospite
prescelto, devono essere posti sotto il controllo di un promotore
attivo in pianta, cioè riconoscibile dalle polimerasi vegetali.
Questo promotore potrà essere costitutivo, cioè
essere funzionale in ogni tessuto dell’ospite, o tessuto-specifico,
ed in tal caso si avrà espressione della proteina solo
in un determinato tessuto della pianta (ad esempio, il tessuto
di riserva dei semi). Il promotore per ora utilizzato è
CaMV 35S, sequenza di DNA derivata dal virus del mosaico del cavolfiore
e capace, in origine, di favorire la riproduzione del virus stesso
in qualunque parte della pianta sia avvenuta l’infezione.
A valle del gene è bene porre un terminatore di trascrizione,
per facilitare il distacco della polimerasi dal filamento di DNA.
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Figure 5
Dalla superficie del callo spunta una vera e propria piantina. |
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Il complesso promotore-gene-terminatore viene quindi inserito
in un T-DNA, all’interno di un plasmide vettore, con capacità
di replicazione sia in Escherichia coli che in Agrobacterium tumefaciens;
questi vettori, detti binari, portano, come tutti i plasmidi utilizzati
in ingegneria genetica, dei geni per la resistenza ad un antibiotico
o ad un diserbante, per permettere la selezione delle cellule
trasformate. Tutte le prime fasi della manipolazione genetica
vengono effettuate in ceppi detossificati di Escherichia coli,
batterio molto più duttile e di rapida moltiplicazione,
e solo all’ultimo viene effettuata la trasformazione di
cellule di agrobatterio.
Una volta effettuati gli opportuni controlli su terreno selettivo,
per verificare il corretto inserimento del plasmide recante il
gene di interesse nell’ultimo batterio ospite, è
possibile effettuare l’infezione di porzioni di foglia.
I “dischetti fogliari” infettati, vengono posti, in
condizioni di stretta sterilità, ancora su terreno selettivo,
in attesa della formazione di un “callo”, proliferazione
cellulare causata dall’agrobatterio (Figura 1). A questo
punto, grazie alla presenza nel terreno di opportuni fito-ormoni
e alla caratteristica totipotenza delle cellule vegetali indifferenziate,
dalle cellule nel cui genoma è entrato il T-DNA con la
relativa resistenza ed il gene di interesse, si sviluppa il germoglio
di una piantina in miniatura (Figura 2, 3 e 4) che, dopo un certo
lasso di tempo, emetterà delle radici (Figura 5) e potrà
essere trasferita dal terreno agarizzato al normale terriccio
(Figura 6).
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Figure 6
Piantine di tabacco GM in via di radicazione su terreno agarizzato. |
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| Piantina di tabacco GM trasferita
in vaso. |
Per due delle linee che sono state portate ad esempio, quella
della filariosi e quella dell’herpes virus equino, la ricerca
è arrivata a questo punto e al momento sono in corso le
analisi per valutare il livello di espressione delle due proteine
nelle piantine di tabacco GM.
Come chiunque abbia avuto esperienza di ricerche di laboratorio
in campo biologico potrà facilmente dedurre, lo studio
qui descritto è tutt’altro che privo di difficoltà,
ma noi, come gli altri gruppi che nel mondo stanno portando avanti
questo genere di ricerche, siamo fermamente convinti che sia una
strada estremamente promettente, sia come alternativa alle soluzioni
già esistenti, sia per risolvere alcuni problemi che non
hanno ancora trovato una soluzione adeguata.
Prof.ssa Barbara Basso
CNR - Universitá degli Studi di Milano
Dipartimento di Biologia
“Luigi Gorini”- Milano
