Veicolazione al neuroblastoma di oligonucleotidi antisenso
specifici per il gene c-myb mediati da immunoliposomi anti-GD2:
attività antitumorali immunomediate.
Riassunto
L’incapsulamento liposomico degli agenti antitumorali induce
una riduzione degli effetti collaterali del farmaco intrappolato
migliorandone l’efficacia terapeutica. La superficie esterna
dell’involucro lipidico può formare dei legami con
anticorpi specifici per antigeni associati al tumore. Gli immunoliposomi
che ne risultano permettono di aumentare l’indice terapeutico
dei farmaci citotossici, minimizzando allo stesso tempo la loro
tossicità sistemica. A questo proposito il disialoganglioside
GD2 è un antigene associato al tumore molto promettente
in quanto si esprime intensamente nei neuroblastomi umani, ma
è rilevabile solo nel normale cervelletto e nei nervi periferici.
Gli immunoliposomi si possono usare come vettori per veicolare
oligonucleotidi antisenso alle cellule tumorali per modularne
l’espressione oncogenica. Inoltre, gli oligonucleotidi antisenso
sono stati oggetto di grande interesse per la loro capacità
di stimolare risposte a carico del sistema immunitario.
In questo contesto descriveremo un nuovo approccio terapeutico
sperimentale per il neuroblastoma basato su oligonucleotidi antisenso
specifici per il gene c-myb mediati da immunoliposomi anti-GD2.
Introduzione
Il Neuroblastoma (NB) è il più comune tumore solido
extracranico dell’infanzia. Nonostante l’applicazione
dei protocolli terapeutici tradizionalmente utilizzati in clinica,
e che prevedono la chirurgia, la radioterapia, la chemioterapia
ad alte dosi ed il trapianto di cellule staminali ematopoietiche,
la sopravvivenza a lungo termine per i pazienti affetti da Neuroblastoma
in stadi avanzati non è stata migliorata in maniera soddisfacente.
In particolare l’utilizzo di alte concentrazioni di farmaci
anti-tumorali porta, nella maggior parte dei casi, ad una diffusa
tossicità sistemica. Una questione emergente, risulta quindi
quella di rendere sempre più selettiva l’azione dei
farmaci utilizzati, al fine di ridurne gli eventuali effetti tossici
e aumentarne, contemporaneamente l’efficacia terapeutica.
Ormai da qualche anno, nel Laboratorio di Oncologia dell’Istituto
G. Gaslini, ci occupiamo di liposomi, vescicole a doppio strato
lipidico, che possono essere utilizzati come eccellenti veicoli
per la somministrazione di farmaci. Essi, infatti, sono in grado
di incrementare l’efficacia terapeutica del farmaco incapsulato
riducendone, al tempo stesso, gli effetti tossici, grazie ad un
più mirato bersagliamento tumorale. I liposomi tendono,
infatti, ad accumularsi a livello tumorale, extravasando attraverso
le fenestrature dei neo vasi formatisi all’interno della
massa tumorale stessa. La selettività di base dei liposomi
può essere ulteriormente migliorata andando a ricoprire
la loro superficie esterna con anticorpi diretti contro antigeni
tumore-associati (immunoliposomi). Il disialoganglioside GD2 è,
a questo riguardo, un antigene tumore-associato molto promettente,
in quanto è largamente espresso da cellule di derivazione
neuroectodermica, come il NB, mentre sulle cellule normali è
espresso blandamente solo da cervelletto e nervi periferici.
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Figura 1
Representative image of the novel lipid-based carrier for
antisense oligonucleotides: antibody-targeted coated cationic
liposomes. |
Lo scopo del mio progetto è quello di utilizzare i liposomi
come veicoli per la somministrazione di oligonucleotidi antisenso.
Gli oligonucleotidi antisenso sono corte sequenze di DNA a singolo
filamento che vengono sintetizzate con lo scopo di appaiarsi,
in modo sequenza-specifico, all’RNA messaggero di una determinata
proteina bersaglio. Questo legame andrebbe ad impedire, come conseguenza,
la traduzione dell’RNA messaggero in proteina.
L’applicazione degli oligonucleotidi antisenso nella ricerca
oncologica trova il suo significato nell’individuazione
di oncogeni e geni tumore-associati che diversificano le cellule
normali da quelle maligne. Oncogeni e geni tumore-associati risultano
quindi, sotto questo punto di vista, ottimi bersagli in quella
che può essere definita “terapia antisenso”.
Il protooncogene c-myb è un fattore trascrizionale molto
ben caratterizzato e la sua espressione è stata individuata
in diverse forme tumorali tra cui anche il Neuroblastoma, dove
è associato alla proliferazione cellulare.
Oltre all’intrinseco effetto sequenza-specifico, gli oligonucleotidi
antisenso possono funzionare attraverso una diversa attività,
legata alla presenza di sequenze CpG (ripetizioni di coppie di
citosina e guanina non metilate). Queste, infatti, sarebbero in
grado di stimolare la risposta immunitaria innata, che si tradurrebbe
in diverse manifestazioni quali ad esempio attivazione di diverse
popolazioni cellulari del sistema immunitario e produzione di
citochine.
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Figura
2
Cell growth inhibition of two GD2-positive NB cell lines
(GI-LI-N and HTLA-230) and two GD2-negative cell lines (HeLa
and Jurkat), by treatment with targeted-liposome-myb-as.
Cells were treated with the liposomal formulation at a concentration
of 100 mg/ml of oligonucleotides from the start of the experiments
and every other day for 8 days. Two hours after each treatment
cells were washed to remove unbound asODNs and transferred
to fresh and complete medium. Finally, cells were detached,
stained with trypan blue and counted by microscope. Data
are expressed as mean ± STD of three different experiments. |
Efficacia terapeutica in vivo di liposomi GD2-targettati
e contenenti oligonucleotidi
anti-c-myb in un modello murino di Neuroblastoma umano.
I liposomi contenenti l’oligonucleotide antisenso per il
c-myb e diretti specificamente contro il GD2 sono stati prodotti
seguendo una metodica già descritta ( Pagnan G. et al,
J Natl Cancer Inst 2000, 923: 253-261). I liposomi così
ottenuti sono stati utilizzati in esperimenti in vivo, con lo
scopo di verificarne l’efficacia terapeutica. Il modello
animale utilizzato è già stato descritto nel nostro
laboratorio (Pastorino F. et al, Cancer Res 2003, 63: 86-92) e
prevede l’inoculo endovena in topi nudi di 3.5 X 106 HTLA-230
(linea cellulare di NB umano). Il protocollo terapeutico prevedeva
l’inizio del trattamento 4 ore dopo l’inoculo delle
cellule. I topi venivano trattati per 2 settimane consecutive,
4 giorni a settimana, con tre giorni di intervallo fra i due blocchi
di trattamento. I gruppi di trattamento erano rappresentati da:
oligonucleotidi antisenso (anti-c-myb) dotati di isole CpG, dati
in forma libera (free CpG-myb-as); liposomi non targettati e contenenti
oligonucleotidi antisenso o sequenze di controllo, entrambe dotati
di isole CpG, (liposome-CpG-myb-as e liposome-CpG-myb-scr); liposomi
targettati contenenti oligonucleotidi antisenso o sequenze di
controllo (targeted-liposome-CpG-myb-as e targeted-liposome-CpG-myb-scr).
I topi di controllo venivano inoculati con “HEPES buffer”.
Fatta eccezione per il gruppo trattato con oligonucleotidi antisenso
dati in forma libera, che mostrano una curva di sopravvivenza
totalmente sovrapponibile a quella dei topi di controllo, tutti
i gruppi di trattamento hanno evidenziato un incremento del tempo
di sopravvivenza ma, solo nei topi trattati con i liposomi targettati
e contenenti la sequenza antisenso si è riscontrata una
percentuale di lungo sopravviventi.
Dal momento che anche i topi trattati con la sequenza di controllo,
incapsulata sia in liposomi GD2-targettati che in quelli non targettati
hanno prodotto un incremento del tempo di sopravvivenza, si intuisce
che i risultati ottenuti derivino da un effetto combinato. Infatti
da un lato agirebbe la specificità dell’oligonucleotide
antisenso, producendo una inibizione dell’espressione della
proteina c-myb, dall’altro giocherebbe un ruolo importante
la stimolazione aspecifica del sistema immunitario, indotta dalla
presenza di isole CpG nello scheletro degli oligonucleotidi utilizzati.
Esperimenti di stimolazione del sistema immunitario.
Esperimenti di stimolazione in vivo del sistema immunitario hanno
confermato la capacità, da parte delle formulazioni liposomiali
contenenti oligonucleotidi dotati di isole CpG, di attivare diverse
popolazioni cellulari del sistema immunitario. Topi nudi, preventivamente
inoculati con la linea di neuroblastoma HTLA-230, hanno ricevuto
una singola iniezione di oligonucleotidi antisenso incapsulati
in liposomi sia targettati che non-targettati. A diversi tempi
dall’iniezione, i topi sono stati sacrificati e sono stati
prelevati milze e sangue periferico.
La valutazione citofluorimetrica, sulle cellule spleniche, dell’antigene
CD69, marker di attivazione precoce, ha dimostrato che i liposomi
targettati sono in grado di indurre l’attivazione di linfociti
B, cellule natural killer (NK) e macrofagi. Inoltre, la cinetica
di attivazione risulta essere molto precoce. Contrariamente, i
liposomi non-targettati non sono in grado di indurre l’attivazione
delle popolazioni sopra citate. Diversamente, la valutazione dell’espressione
del CD69 su macrofagi da sangue periferico ha evidenziato che
entrambe le formulazioni sono in grado di indurne l’attivazione
con una cinetica tempo dipendente.
Gli stessi risultati sono stati confermati anche in esperimenti
in vitro. In questo caso cellule derivate da milze di topi nudi
sono state stimolate in vitro e successivamente è stata
valutata l’espressione del CD69. I liposomi targettati si
sono dimostrati efficaci nell’attivare diverse popolazioni
cellulari: linfociti B, cellule NK, macrofagi, granulociti e cellule
dendritiche.
Una conferma ulteriore del potere “immuno stimolante”
delle formulazioni liposomiali contenenti oligonucleotidi dotati
di isole CpG deriva dalla quantificazione di citochine (IL-12,
INF-g, IL-1b e TNF-a) nel siero di topi trattati. I liposomi targettati
risultavano più efficaci, rispetto a quelli non-targettati,
nell’induzione di tutte le citochine sopra citate. Le cinetiche
di secrezione, considerate insieme ai risultati di attivazione
cellulare, fanno ipotizzare che l’IL-12 possa essere prodotta
precocemente dai macrofagi. Tramite un fenomeno a cascata l’IL-12
andrebbe ad attivare le cellule NK che, a loro volta, andrebbero
a secernere IFN-g .
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Figura
3
Survival of NB-bearing nude mice after injection of oligonucleotides,
either free or encapsulated within liposomal formulations.
Nude mice were injected intravenously with 3.5 X 106 HTLA-230
neuroblastoma cells. After 4 hours, each mouse received
50 mg of oligonucleotides, either free or encapsulated in
targeted or non-targeted liposomes. Control mice received
HEPES-buffered saline. Data are representative of three
different experiments.
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Importanza delle cellule Natural Killer nell’approccio
terapeutico utilizzato.
Nel modello murino utilizzato (topi nudi) che manca di cellule
T, la popolazione a cui può essere principalmente imputata
un’azione litica nei confronti delle cellule tumorali è
rappresentata dalle cellule NK. Per confermare questa ipotesi
sono stati condotti due diversi tipi di esperimenti:
1) saggio di citotossicità in vitro (rilascio di 51Cr);
2) esperimenti terapeutici condotti su topi SCID-bg (mancanti
di cellule NK, oltre che di cellule B e T).
Contemporaneamente sono stati condotti esperimenti terapeutici
anche su topi sottoposti ad ablazione chimica di macrofagi, per
confermare l’importanza di questa popolazione cellulare
nella cascata di attivazione da noi ipotizzata.
Splenociti, derivati da topi nudi (inoculati con cellule di NB)
trattati con liposomi targettati o non-targettati, sono stati
usati come cellule effettrici nel saggio di citotossicità.
Come cellule target sono state utilizzate le HTLA-230 (marcate
con 51Cr). I risultati hanno dimostrato che gli splenociti, derivati
da topi inoculati con liposomi targettati e non-targettati contenenti
oligonucleotidi antisenso dotati di isole CpG, sono in grado di
lisare in maniera specifica e tempo dipendente le cellule target.
La conferma finale dell’effettiva importanza delle cellule
NK nel nostro approccio terapeutico deriva dai sopracitati esperimenti
di sopravvivenza condotti in topi SCID-bg. In questo caso la mancanza
di cellule NK porta ad una totale perdita di efficacia anti-tumorale
per i topi trattati con liposomi targettati e contenenti una sequenza
di controllo, ma pur sempre dotata di isole CpG. Nei topi trattati
con i liposomi targettati e contenenti oligonucleotidi antisenso
per il c-myb invece, viene mantenuta una parziale efficacia dovuta
all’effetto specifico dell’oligonucleotide antisenso.
Inoltre, l’ablazione dei macrofagi, effettuata chimicamente
mediante l’utilizzo di liposomi contenenti clodronato porta,
come supposto, anche in questo caso, alla perdita dell’efficacia
terapeutica, sottolineando il ruolo fondamentale di questa popolazione
cellulare.
Conclusioni
In conclusione è stata dimostrata l’efficacia terapeutica
di liposomi GD2-targettati e contenenti oligonucleotidi anti-c-myb
dotati di isole CpG in un modello.
Brignole C., Pastorino F.,
Marimpietri D., Di Paolo D.,
Zancolli M., Pagnan G., Ponzoni M.
Servizio per la terapia di differenziazione,
Laboratorio di oncologia,
Ospedale pediatrico G. Gaslini,
Genova, Italia.
