Riassunto
In questa pubblicazione riportiamo gli studi effettuati sul processo di regolazione della crescita del cancro da parte di fattori presenti nell’embrione nel corso di precise fasi della differenziazione cellulare. Questa relazione riassume i risultati ottenuti da una serie di esperimenti in vitro ed in vivo effettuati nel corso degli ultimi 18 anni e che hanno seguito diverse metodologie, quali test sul modello animale, valutazioni della citotossicità, metodi immunoistochimici, citometria a flusso e biologia molecolare. Questi studi sulla normale differenziazione cellulare e sulla regolazione della crescita patologica delle cellule indifferenziate mutate, quali sono le cellule tumorali, hanno chiarito il modo in cui i fattori della fase di differenziazione delle cellule staminali embrionali possono essere utilizzati nel trattamento dei tumori. Gli studi in merito all’uso dei fattori della fase di differenziazione delle cellule staminali per controllare la crescita del tumore sono in corso e saranno l’oggetto della prossima pubblicazione.
Introduzione
Nel corso della gravidanza si viene a creare una stretta interazione tra la madre e l’embrione in fase di sviluppo che consiste in una complessa rete di fattori molecolari. Tale interazione è necessaria per prevenire le cause che possono mettere a rischio la gravidanza stessa, ivi compresa la creazione di cloni cellulari in proliferazione anomala ,che possono danneggiare l’integrità.dell’embrione. Questo problema è già stato affrontato da altri gruppi che hanno rivolto la loro attenzione a cloni attivati di cellule T attraverso l’interfaccia madre-embrione.1,2 In studi precedenti è stato descritto il modello che lega lo sviluppo embrionale alla carcinogenesi, cioè l’avvio di un programma proliferativo anomalo.3 Lo sviluppo di un modello teorico della regolazione genica delle cellule tumorali da parte di fattori presenti nel microambiente embrionale è il frutto di un lavoro pluriennale condotto sia in vitro che in vivo. In questa breve pubblicazione vengono riassunti i risultati di questo lavoro.
Risultati in Vitro
La somministrazione di sostanze di embrioni di Danio rerio prelevati in precise fasi di sviluppo, cioè 1000 blastomeri (fase di completa segmentazione), epibolia al 50% (corrispondente all’inizio della gastrulazione), 5 somiti e 20 somiti è stata effettuata su cellule di glioblastoma, melanoma, adenocarcinoma del rene, carcinoma della mammella e di leucemia linfoblastica.Le curve di proliferazione sono state analizzate 24 e 48 ore dopo il trattamento.4 Tutte le linee cellulari hanno mostrato un rallentamento della loro crescita quando trattate con sostanze prelevate nel corso delle fasi di differenziazione cellulare, cioè a partire da epibolia al 50%. Ogni linea cellulare ha avuto un rallentamento specifico ed ha mostrato una propria reazione al trattamento con i diversi stadi di differenzazione: per esempio la proliferazione di glioblastoma è stata inibita più dallo stadio di epiblobia al 50% e meno dallo stadio di con 20 somiti, mentre le cellule del melanoma sono state rallentate di più dallo stadio a 5 somiti e le cellule dell’adenocarcinoma del rene dallo stadio a 20 somiti. Le cellule di glioblastoma, di melanoma, di carcinoma della mammella e le cellule della leucemia linfoblastica hanno risposto in maniera significativa al trattamento a partire dalle 24 ore, mentre le cellule dell’adenocarcinoma del rene non hanno mostrato alcun rallentamento dopo tale termine. Dopo le 48 ore, però, tutte le linee cellulari hanno evidenziato un’inibizione con percentuali che vanno dal 73% delle cellule del glioblastoma al 26% delle cellule del melanoma trattate con sostanze prelevate dallo stadio di epibolia (nel corso della quale le cellule staminali totipotenti embrionali si differenziano in cellule staminali pluripotenti). Fig. 1, 2, 3, 4, 5
Nessuna rallentamento è stato evidenziato nelle cellule tumorali trattate con sostanze prese dallo stadio di sviluppo a 1000 blastomeri (chiamata fase 1k).4 Al contrario le cellule trattate hanno mostrato una debole risposta proliferativa... Fig. 6, 7, 8, 9 Questa prova rafforza la nostra opinione che gli stadi di differenziazione dello sviluppo embrionale sono caratterizzati da reti di molecole regolatrici che reindirizzano le cellule tumorali verso un percorso normalizzato di differenziazione e che queste reti partono dall’inizio della gastrulazione. Prima della gastrulazione, gli embrioni sono sottoposti a stimoli di natura moltiplicativa, che non riescono a ridurre la proliferazione delle cellule tumorali. Un effetto di rallentamento sulla crescita tumorale è stato anche osservato con l’uso di estratti grezzi di mucosa uterina in gravida.5 Le cellule trattate con mucosa uterina di suino prelevata a 23 giorni di gestazione hanno mostrato curve di proliferazione più lente con valori percentuali di inibizione che vanno dal 80% del carcinoma mammario al 67% delle cellule della leucemia limfoblastica al 22% delle cellule del glioblastoma. Proprio come osservato in precedenza sostanze prelevate dall’embrione di Danio rerio, ogni linea cellulare ha risposto al trattamento con estratti di mucosa uterina in modo diverso. Il giorno di gestazione in cui è stata prelevata la mucosa sembra non influire sulla reazione delle cellule tumorali poiché il trattamento delle cellule del glioblastoma con sostanze di mucosa uterina prelevata da topi in gestazione a giorni diversi ha portato ad un diffuso rallentamento delle curve di proliferazione con valori di percentuale di inibizione che non differiscono in maniera significativa uno dall’altro. In fine l’effetto delle sostanze della mucosa uterina sulla crescita cellulare sembra dover essere ascritta solo alle linee delle cellule tumorali in quanto il trattamento di una linea non tumorale,quale quella rappresentata da fibroblasti murini NIH 3T3, non ha portato ad un cambiamento della curva di proliferazione cellulare. Fig. 10
Al fine di chiarire quali fattori siano responsabili di questa azione, abbiamo sottoposto gli estratti grezzi di mucosa uterina al frazionamento con diversi setacci molecolari .Abbiamo quindi isolato una frazione di basso peso molecolare di (5 kDa) che ha mantenuto la capacità di rallentamento sulla crescita delle cellule tumorali. Fig. 11,11a Abbiamo chiamato questa frazione “Life-Protecting Factor” (LPF) in quanto potrebbe contenere molecole coinvolte nel processo di preservazione dell’integrità materno-embrionale da cloni cellulari patogeni. Il meccanismo di azione di LPF è legato ad un evento apoptotico , in quanto abbiamo osservato alti livelli di una frazione nucleosomale nel mezzo di coltura delle cellule tumorali dopo 24 ore dal trattamento. Fig. 12 Con diverse tecniche si sono anche analizzate le basi molecolari di questo meccanismo di rallentamento della proliferazione sulle linee cellulari. L’analisi con citometria a flusso ha rivelato un aumento medio del 20% nell’attivazione dell’antioncogene p53 in cellule di glioblastoma Fig. 13 e melanoma dopo il trattamento con sostanze prelevate dall’embrione di Danio rerio6 L’analisi immunoistochimica sulle cellule trattate di melanoma ed epatocarcinoma ha mostrato un drammatico aumento di p53 rispetto a cellule non trattate.6 Si è anche notato che non tutte le sostanze embrionali sono state capaci di indurre una attivazione di p53, confermando che solo precise fasi di differenziazione sono caratterizzate da un potenziale di rallentamento della crescita del tumore. Oltre al p53, si è dimostrato che un altro effettore chiave delle omeostasi del ciclo cellulare, la proteina pRb, è influenzato dal trattamento dei fattori embrionali attraverso l’alterazione del suo stato di fosforilazione. Fig. 14
Risultati in Vivo
L’azione dei fattori embrionali e della decidua sulla crescita tumorale è stata osservata anche in vivo tramite l’impianto di cellule primitive di carcinoma di Lewis in femmine di topi singeneici C57BL/6J.7 Immediatamente prima dell’iniezione sono state aggiunte alle cellule tumorali sostanze prelevate dall’utero di topi a nove giorni di gestazione, da un utero non in gestazione, da embrioni di 9 giorni o dal fegato (quest’ultimo in qualità di controllo negativo). Solo le cellule tumorali che sono state trattate con le sostanze prelevate dall’utero in gestazione non hanno originato tumori primitivi: la crescita è risultata nulla per tutto il tempo dell’esperimento. Fig. 16 Risultati simili sono stati ottenuti in un altro esperimento con la somministrazione di sostanze prelevate da embrioni di Drosophila allo stadio di blastoderma. I topi ai quali sono stati impiantate cellule del tumore di Lewis,15 giorni dopo il trattamento con sostanze prelevate dal blastoderma hanno evidenziato che il tumore primitivo si era ridotto in misura pari al 35% rispetto ai controlli.8
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Conclusioni
I dati sperimentali in vitro e in vivo evidenziano che la proliferazione cellulare anomala è in qualche modo influenzata da fattori che si trovano negli embrioni e/o nell’utero in gestazione. Questi fattori sono organizzati in una rete la cui complessità non dovrebbe andare dispersa per mantenere la sua piena efficacia. Ciò è particolarmente vero per quanto riguarda l’embrione il cui microambiente è in grado di normalizzare il comportamento di popolazioni di cellule in crescita anomala . Ciò avviene attraverso un processo di regolazione che coinvolge proteine fondamentali per l’omeostasi del ciclo cellulare.
Nel caso del microambiente rappresentato dal sistema utero-embrione il processo di blocco di cloni cellulari tumorali è dovuto a sostanze quali ad esempio LPF, che inducono una rapida apoptosi. Un punto fondamentale delle nostre scoperte è che solo le reti presenti in fasi differenziative dello sviluppo embrionale sono in grado di rallentare la crescita tumorale in quanto le reti presenti nelle fasi moltiplicative non sono efficaci o, persino, hanno un leggero effetto proliferativo sulle linee cellulari.
Le tappe future della nostra ricerca saranno l’isolamento dei singoli componenti di queste reti. La caratterizzazione di ogni singola molecola coinvolta in questo tipo di regolazione sarà importante per approfondire la conoscenza dei meccanismi più stretti del funzionamento di questo micro- ambiente. Una prospettiva interessante è quella di focalizzarsi sul ruolo delle cellule staminali. Le cellule staminali possono essere programmate in diversi tipi cellulari in base alla catena di fattori che costituisce il microambiente circostante. Per esempio le cellule staminali neurali possono differenziarsi in cellule della linea ematopoietica quando vengono messe in contatto con il microambiente ematopoietico9 o in cellule muscolo-scheletriche quando vengono messe in contatto con i fattori della differenziazione muscolo-scheletrica.10 A loro volta cellule staminali programmate nelle prime fasi possono esprimere una catena di fattori di differenziazione che, se somministrati ad una cellula tumorale, potrebbero portarla alla normalizzazione. Noi stiamo ora studiando i fattori di differenziazione delle cellule staminali presenti nella fase di epibolia al 50% nella quale le cellule staminali embrionali totipotenti si differenziano in cellule staminali pluripotenti.
Questi studi sono in corso e stanno dimostrando che questi fattori sono in grado di ritardare la crescita di varie linee tumorali controllando il meccanismo del ciclo cellulare delle cellule tumorali. Questi studi saranno l’oggetto della prossima pubblicazione.
Pier Mario Biava, D. Bonsignorio
Fondazione per la Ricerca delle
Terapie Biologiche del Cancro. Ospedale
di Sesto S. G. - Viale Matteotti 83
Milano, Italia
Janis V. Klavins
Albert Einstein College of Medicine,
New York, NY, USA.
