Stem cells maturation arrest
and differentiation therapy.

S. Sell

Tutti i tessuti del corpo derivano dalla proliferazione e differenziazione delle cellule staminali. Il concetto che i tessuti adulti contengono i residui embrionali, in genere dormienti, ma che si possono attivare per diventare un carcinoma, è stato formulato per la prima volta come la teoria del “residuo embrionale” del cancro nella metà del diciannovesimo secolo.
Questa ipotesi è stata rivisitata negli anni ‘60 quando Roy Stevens dimostrò che le cellule germinali prelevate da testicoli adulti potevano formare dei teratocarcinomi e Barry Pierce dimostrò che lo sviluppo dei teratocarcinomi era il risultato della mancata differenziazione delle cellule staminali carcinomatose embrionali, es. “arresto della maturazione”. Tuttavia, fino al 99% dei teratocarcinomi può essere composto da cellule tissutali mature allo stadio terminale della differenziazione. Se il carcinoma deriva dall’arresto della maturazione delle cellule staminali carcinomatose in proliferazione, allora rimuovere questo arresto dovrebbe permettere alle cellule carcinomatose di riprendere la differenziazione. È possibile superare l’arresto della maturazione delle cellule staminali carcinomatose embrionali, inducendole a differenziarsi mediante il trapianto di cellule staminali carcinomatose embrionali nelle blastocisti normali o mediante il trattamento con i retinoidi. Questo ha portato al concetto della “terapia di differenziazione” del cancro.
Un esempio illustrativo dell’arresto della maturazione e della terapia di differenziazione è rappresentato dalla traslocazione genica nelle cellule staminali ematopoietiche che porta ad alterazioni specifiche dell’espressione genica che si manifesta come arresto della maturazione ad uno stadio specifico della differenziazione dei leucociti (leucemie) che è possibile invertire mediante trattamenti specifici che rimuovono il blocco della differenziazione. Si sta oggi documentando l’origine degli altri tumori derivanti dalle cellule staminali tissutali. Ad esempio, la “promozione” di un carcinoma epidermico si può realizzare mesi o persino anni dopo l’esposizione iniziale all’agente carcinogeno (“iniziazione”). Dal momento che tutte le cellule staminali epiteliali vengono sostituite ogni 2 settimane, questo implica che l’evento carcinogeno originale ha luogo in una popolazione di cellule staminali epiteliali che ha vissuto a lungo. Anche gli organi con un rinnovamento delle cellule normali molto lento come il fegato contengono cellule staminali tissutali. Benché il rinnovamento delle cellule epatiche normali sia molto lento (una volta ogni 1-2 anni) rispetto al tratto gastrointestinale (una volta la settimana), il fegato può rispondere alle lesioni con una rapida proliferazione degli epatociti maturi, un referto che ha portato alla convinzione che il fegato non contenesse cellule staminali come gli altri organi. Tuttavia, c’è una rapida proliferazione delle cellule staminali epatiche putative in risposta a lesioni quando viene inibita la proliferazione degli epatociti maturi e gli eventi cellulari che hanno luogo durante l’epatocarcinogenesi chimica basata su vari protocolli sostengono la conclusione che i carcinomi possono risultare dalle cellule progenitrici epatiche in vari stadi di differenziazione nel ceppo degli epatociti. I risultati ottenuti di recente rafforzano la conclusione che il carcinoma polmonare deriva dalle cellule staminali a livello dei bronchioli terminali. Verranno presentati i risultati che indicano che le cellule staminali derivanti dal midollo osseo possono dare luogo alle cellule precursori del carcinoma epatico e al carcinoma gastrointestinale. La comprensione dei segnali che controllano lo sviluppo e la differenziazione normale di varie cellule di ceppi tissutali può col tempo fornirci dei modi per trattare molti tumori mediante la terapia della differenziazione.
Nel carcinoma mammario in cui le cellule staminali carcinomatose si possono identificare dalle cellule delle popolazioni marginali che escludono il colorante Hoescht 33342 il numero delle cellule staminali carcinomatose proliferanti varia da meno dell’1% al 100%. Se fosse possibile bloccare i segnali che permettono a queste cellule di restare cellule staminali, si dovrebbe poter costringere le cellule a differenziarsi.

S. Sell
Wadsworth Center and
Ordway Research Institute,
Albany,
NY, USA

 

The use of stem cells differentiation stage
factors in controlling tumor growth-a new model of cancer.

P. M. Biava

Gli studi svolti da noi in precedenza suggeriscono che lo sviluppo tumorale nell’embrione viene ridotto o soppresso quando i processi di differenziazione cellulare sono in corso. Infatti questi studi hanno dimostrato che i fattori presenti negli embrioni di ovipari e negli uteri gravidi dei mammiferi possono ritardare o anche sopprimere la crescita dei tumori.
L’inoculazione sottocutanea in vivo delle cellule del carcinoma polmonare di Lewis nei topi C57BL/6J non è riuscita a dare origine né a tumori primitivi né a metastasi quando le cellule tumorali sono state mescolate con estratti della mucosa uterina prelevata da topi al 9° giorno di gravidanza. Inoltre i tumori trattati con embrioni di ovipari presi allo stadio di blastoderma si sono sviluppati in modo significativamente ridotto rispetto ai controlli.
Questi risultati in vivo sono stati confermati da quelli in vitro in esperimenti con varie linee cellulari di tumori umani di origine diversa trattate con i fattori embrionali ottenuti dallo zebrafish, soprattutto con quelli prelevati durante lo stadio in cui le cellule staminali totipotenti si differenziano nelle cellule staminali pluripotenti (50% stadio di epibolia).
Le cellule trattate con le sostanze dello zebrafish prelevate in fasi precise della differenziazione embrionaria hanno dimostrato un calo significativo nel tasso di crescita con valori medi di inibizione della crescita compresi fra 25% e 80% a seconda della linea cellulare. Ulteriori studi sono stati eseguiti per individuare quali percorsi di regolazione cellulare sono coinvolti in questo meccanismo di inibizione della crescita tumorale.
È stato dimostrato che le molecole fondamentali per la regolazione del ciclo cellulare, come p53 e pRb, sono coinvolte attraverso eventi di trascrizione e post-traduzionali.
Sono stati osservati cambiamenti nei livelli di espressione di p53 dopo il trattamento delle cellule con i fattori di differenziazione embrionale, come pure cambiamenti nel pattern di fosforilazione di pRb; questi ultimi modificavano il rapporto delle forme pRb iperfosforilate/ipofosforilate all’interno dell’intera popolazione di cellule trattate.
Nello studio degli effetti degli estratti di mucosa uterina gravida sulle cellule tumorali, l’interesse si è incentrato su una frazione a basso peso molecolare (5 kDa) con proprietà antiproliferative isolata dalla mucosa uterina dei maiali gravidi e chiamata “fattore di protezione della vita” (LPF).
Studi preliminari svolti in vitro hanno dimostrato che la frazione aveva la stessa efficacia dell’intero estratto di mucosa uterina nel ritardare la crescita tumorale attraverso eventi apoptotici.
È stato proposto un nuovo modello di cancro sulla base di questi studi in vitro e in vivo.
Questo modello concepisce la carcinogenesi come un processo di caos deterministico.
Si tratta di un processo di ramificazione, che porta la cellula ad un’instabilità genetica predominante: l’attrattore finale è una nuova “configurazione genica” stabile simile a quella presente negli embrioni durante gli stadi di moltiplicazione compresi fra due stadi di differenziazione.
Infatti le cellule carcinomatose:
1) hanno proto-oncogeni o oncogeni attivati,
2) producono i fattori di crescita embrionali,
3) non sono sensibili ai segnali di stop alla crescita,
4) hanno vari antigeni di superficie noti come antigeni oncofetali, che sono mantenuti durante la filogenesi. Le cellule tumorali e quelle embrionali condividono alcuni percorsi molecolari e i loro principali effettori: es. il percorso APC/beta catenin /TCF/ Wnt e il percorso Hedgehog/Smoothened/Patched. Nello sviluppo embrionale questi percorsi portano le cellule ad una differenziazione efficace, mentre nella tumorigenesi le loro rispettive controparti mutate portano le cellule ad una moltiplicazione costante.
L’uso delle sostanze embrionali prelevate durante fasi precise della differenziazione cellulare soprattutto durante lo stadio in cui le cellule staminali totipotenti si differenziano in cellule staminali pluripotenti può fermare o ritardare la crescita tumorale, bypassando le mutazione che danno luogo ai tumori maligni.

P. M. Biava
Foundation for Research into
the Biological Therapies of Cancer
Sesto San Giovanni Hospital
Sesto S.Giovanni
Milan, Italy.

Apoptosis, phenotype differentiation and growth inhibition of colon cancer cells (Caco2) induced by Zebrafish embryo proteins.

M. Bizzarri

Gli studi precedentemente svolti hanno dimostrato che un gruppo di proteine regolatrici estratte dall'embrione dei pesci durante i processi di differenziazione hanno condiviso delle caratteristiche citotossiche con varie linee cellulari carcinomatose.
Uno studio sperimentale è stato eseguito per accertare le proprietà inibitorie e pro-apoptotiche di questa rete proteica. La conta cellulare totale, il test della sulfonamide b (SRB test), i parametri apoptotici (caspasi 3 e 8, FLIP, pRb, p53, Myc, E2F) sono stati ottenuti dalla linea cellulare del carcinoma del colon (Caco2) trattata con concentrazioni in graduale aumento di estratti embrionali (E1 3 µg/ml e E2 0,3 µg/ml) in associazione o meno con 5-Fluorouracil (5FU) nel range terapeutico subottimale (0,1 mg/ml, FU1).
La proliferazione delle cellule carcinomatose è stata inibita in modo dose-dipendente significativo da estratti embrionali e sono stati evidenziati effetti aggiuntivi di rafforzamento in associazione al 5FU. A 48 ore il tasso d'inibizione aumenta dal 68% (FU1 da solo) al 75% e all'82% rispettivamente nei campioni trattati con E2+FU1 e E1+FU1; l'effetto più potente di inibizione della crescita è stato registrato nel braccio Fu+E1 (l'82% a 48 ore e il 92% a 96 ore). Questo pattern è difatti strettamente associato alle caratteristiche pro-apoptotiche condivise dagli estratti embrionali combinati con il 5FU. Le cellule Caco2 trattate con E1/2 hanno dimostrato un aumento marcato della frazione G2/M. Le proteine embrionali hanno condiviso un effetto apoptotico significativo (+128% e +147%, per E1 ed E2 rispettivamente).
Nelle cellule tumorali trattate sia con Fu+E1 che con Fu+E2, l'indice apoptotico aumenta in modo significativo da 41 a 46 rispettivamente, evidenziando un effetto apoptotico aggiuntivo efficace fra il Fu e le proteine embrionali.
Le cellule Caco2 trattate sia con Fu che con E1-E2 hanno presentato un aumento dell'attività delle caspasi-8 mentre un effetto di rafforzamento selettivo dell'attività delle caspasi-3 è stato registrato solo nelle cellule trattate con proteine embrionali. Un aumento significativo delle forme fosforilate pRb che porta ad un aumento dell'E2F-1 è stato indotto dalle proteine embrionali, assieme ad una sovraespressione paradossale del c-Myc.
Secondo quanto è stato riferito per altre linee cellulari di carcinoma del colon, questi dati sostengono l'evidenza di un effetto rafforzante apoptotico specifico condiviso dagli estratti embrionali. Infine, le proteine embrionali aumentano la sintesi dell'E-caderina con una riduzione concomitante dell'espressione della ß-catenina - esercitando in questo modo un chiaro effetto di differenziazione sulle cellule tumorali del colon.
Questi risultati preliminari sono incoraggianti e suggeriscono che i fattori embrionali di differenziazione possono migliorare l'efficacia della chemioterapia, pur interferendo in modo autonomo e complesso sulle cellule carcinomatose (inibizione della crescita, induzione apoptotica ed effetti di differenziazione) rispetto a quella registrata con il fluorouracile.

A. Cucina1 , M. Bizzarri2, L. Frati2, P. Coluccia1, F. D’Anselmo1,
B. Borriello2, F. Conti3, A. Miccheli3 ,A. Gulino2, P. M. Biava4
1 Dept. of Surgery “Pietro Valdoni”.
2 Dept. of Experimental Medicine and Pathology.
3 Dept. of Chemistry. 4 Foundation for research into the
biological therapies of cancer Sesto S. G. Hospital - Sesto S. Giovanni
Milan Italy

Efficacy of stem cells differentiation stage
factors in intermediate-advanced hepatocellular carcinoma.

T. Livraghi

Premessa e obiettivo. Non esiste un trattamento standard per i pazienti che presentano un carcinoma epatocellulare allo stadio avanzato. Abbiamo creato un prodotto che contiene sostanze prelevate dalla fase in cui le cellule staminali embrionali si differenziano nelle cellule staminali adulte e che inibisce la carcinogenesi negli studi effettuati in laboratorio.
Lo scopo di questo studio aperto randomizzato era di valutare la sua efficacia nei pazienti con un carcinoma epatocellulare non idoneo alla resezione, al trapianto, alla terapia ablativa o alla chemioembolizzazione arteriosa.
Metodi. È stato arruolato un totale di 179 pazienti consecutivi. Abbiamo assegnato a caso i pazienti che dovevano ricevere i regolatori della differenziazione delle cellule staminali o la sola terapia conservativa. Gli obiettivi principali erano la risposta tumorale e la sopravvivenza. Gli obiettivi secondari erano il performance status e la tolleranza del paziente.
Esito
La randomizzazione è stata interrotta alla seconda analisi intermedia (6 mesi) dei primi 32 pazienti arruolati quando il controllo ha rilevato una differenza significativa a favore del trattamento con i regolatori della differenziazione delle cellule staminali.
I risultati ottenuti in altri 154 pazienti hanno confermato i risultati precedenti. Analizzando i 151 pazienti valutabili, si sono riscontrati: 4 risposte complete, 26 regressioni, 24 casi di malattia stabile e 97 casi di progressione della malattia. La valutazione della sopravvivenza ha dimostrato una differenza significativa fra il gruppo di pazienti con una risposta obiettiva e una malattia stabile rispetto al gruppo che presentava la progressione della malattia. Dei 23 pazienti trattati con un performance status uguale a 1, 19 si sono cambiati in 0.
Conclusioni.
Lo studio ha indicato che il trattamento con i regolatori della differenziazione delle cellule staminali dei pazienti con carcinoma epatocellulare intermedio-avanzato era efficace per quanto riguarda la risposta completa o regressione nel 19,8% e per quanto riguarda la malattia stabile nel 16%, con un miglioramento nella sopravvivenza dei pazienti responder rispetto ai non responder e nel performance status per la maggior parte dei pazienti.

T. Livraghi1, F. Meloni1, S. Lazzaroni2, A. Frosi3,
M. Bizzarri4, L. Frati4, P. M. Biava5
1 Department of Radiology, Civil Hospital of Vimercate,
Vimercate, Milan;
2 Department of Internal Medicine, San Biagio Hospital, Clusone, Bergamo;
3 Hepatology-Gastroenterology Unit, Internal Medicine Department,
Sesto S. Giovanni Civil Hospital, Milan;
4 Department of Experimental Medicine, La Sapienza University, Rome;
5 Foundation for Research into the Biological Therapies of Cancer,
Sesto S. Giovanni Civil Hospital,
Milan, Italy