Abstract
La Metabolomica è stata inclusa tra le dieci tecnologie
emergenti in un recente articolo pubblicato su Technology Review
del MIT di Boston.
La Metabolommica descrive il profilo chimico in termini dei metabolici
a basso peso molecolare presenti in cellule, tessuti, organi e
fluidi biologici. Le sue componenti (i metaboliti) possono essere
visti come il prodotto finale dell'espressione genica o dell'attività
proteica (enzimi), che definiscono così il fenotipo biochimico
di un sistema biologico nel suo insieme, compreso l'uomo. Mentre
la gnomica e la proteomica suggeriscono un possibile modo di funzionamento
del sistema, la metabolomica dà la rappresentazione reale
del sistema.
Nei prossimi anni l'approccio metabolomico, combinato con la gnomica
funzionale e la proteomica, avrà un fortissimo impatto
sulla ricerca in campo farmacologico, nella diagnostica, nella
terapia e in un'ampia gamma di biotecnologie. In questo articolo
saranno brevemente descritte le basi teoriche e sperimentali dell'analisi
metabolomica, così come alcune applicazioni nella ricerca
sul cancro. Alexander Bogdanov nel suo "Tektology: Universal
organization Science" (1913-1922) ipotizzava che tutte le
Scienze fisiche, biologiche ed umane potrebbero essere unificate
trattandole come un insieme di relazioni, evidenziando che i principi
organizzazionali sono alla base di tutti i sistemi. I sistemi
viventi funzionano mediante una vasta gamma di reazioni per lo
più catalizzate da Enzimi e processi di trasporto che attraverso
la trasformazione di migliaia di sostanze, con le stesse leggi
della Termodinamica e Cinetica che governano il mondo non vivente,
determinano flussi di materia e di energia necessari per la loro
vita e per il loro funzionamento.
L’insieme di tali flussi rappresenta il metabolismo. Gran
parte delle metafore usate per descrivere un principio unificante,
che permettesse l’interpretazione del funzionamento di un
sistema biologico, sono state nel tempo riferite alla tecnologia
emergente, considerata come la "più potente ed avanzata"
nel dato momento storico. Così nel secolo XVIII i sistemi
biologici erano paragonati alla meccanica di un orologio, nel
XIX secolo alle macchine termodinamiche, nel XX secolo ai computer
digitali guidati da porte logiche, fino ad arrivare ad oggi, nel
secolo governato dal world-wideweb (www.), dove i sistemi biologici
sono rappresentati come “network”.
Fino a pochi anni fa, il paradigma dominante, nella rappresentazione
del funzionamento di un sistema biologico, era dettato da una
visione gerarchica dall’alto verso il basso, dove il controllo
del sistema era generato dal genoma fino ad arrivare ai livelli
gerarchici più bassi rappresentati dagli aspetti fisiologici
e funzionali. Veniva così definita una gerarchia di livelli:
geni ? trascritti ? proteine ? metaboliti (fig.1), con la quale
si postulava che la identificazione della sequenza genica di un
sistema biologico sarebbe stata da sola sufficiente per prevedere
le principali caratteristiche funzionali.
Tuttavia, in seguito al rapido sviluppo delle tecnologie biomolecolari,
che hanno permesso il completo sequenziamento del genoma di alcuni
organismi viventi, compreso anche parte di quello umano, è
divenuto evidente che un tale approccio forniva soltanto una possibilità
di valutazione e previsione della evoluzione dei processi indotti
da una perturbazione sia essa dovuta a modifiche geniche, o a
stimoli esterni chimici e/o fisici, in termini di risposta dell’intero
organismo.
Uno dei principali limiti inerenti a tale approccio consiste nella
impossibilità di interpretare e comprendere il funzionamento
di un sistema vivente integrale, qual è la stessa cellula,
sulla base di una ricostruzione che utilizza le conoscenze delle
caratteristiche e proprietà separatamente dei singoli componenti
del sistema (approccio riduzionistico).
In realtà un sistema vivente si modifica continuamente
in dipendenza dello stato fisiologico (ad esempio cellule proliferanti
durante le diverse fasi del ciclo cellulare) e delle interazioni
con l’ambiente esterno, come risposta a stimoli chimici
e/o fisici, modifiche geniche, determinando la variazione o l’insorgere
di nuove strutture che la plasticità del sistema permette,
consentendo nuove strategie di funzionamento fino all’insorgenza
di uno stato patologico.
Un sistema biologico, come sistema complesso, può trovare
vie alternative per i processi che determinano i flussi di materia
ed energia, rispettando sempre le leggi termodinamiche e cinetiche.
In altri termini un sistema complesso, come è una cellula,
esercita un controllo sul suo funzionamento attraverso non una
struttura gerarchica rigida dai geni alle proteine e ai metaboliti,
ma attraverso una struttura organizzata con interconnessioni tra
il patrimonio genetico, proteico e metabolico, in maniera globale
e flessibile (fig.1).
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Fig.1
Flusso delle informazioni biologiche |
Si è quindi realizzata negli ultimi anni la necessità
di considerare in maniera complementare le innumerevoli informazioni
che provengono dalle nascenti discipline omiche, quali la genomica,
la proteomica e la metabolomica. In particolare il termine metaboloma
descrive il profilo chimico in termini di metaboliti di basso
peso molecolare presenti in cellule, tessuti, organi o fluidi
biologici.
I suoi componenti (metaboliti) possono esser visti come i prodotti
finali della espressione genica e dell’attività proteica
(enzimi) definendo così il fenotipo biochimico di un sistema
biologico integrale, compreso l’uomo. Ne deriva che la metabolomica
fornisce una risposta attuale e non potenziale sul funzionamento
in modo globale ed interconnesso con la genomica e la proteomica.
Così il metaboloma, valutato sui fluidi biologici di un
uomo, ad esempio, riflette la sua storia, compresa l’età,
il sesso, lo stile di vita, lo stato nutrizionale, le interazioni
con l’ambiente, possibili stati patologici, l’effetto
di terapie farmacologiche.
Anche se ancora agli albori, i risultati ottenuti ad oggi sembrano
essere importanti non solo da un punto di vista scientifico di
base, ma anche applicativo, con ricadute sul piano economico e
pratico. Ad esempio la valutazione qualitativa e quantitativa
contemporanea ed in funzione del tempo di un consistente numero
di metaboliti, come quelli determinabili mediante RMN o spettrometria
di massa in fluidi biologici è in grado di fornire, con
una accettabile probabilità, la descrizione dello stato
biochimico attuale di un organismo, fornendo informazioni sulle
interrelazioni tra i diversi processi metabolici che definiscono
lo stato.
Si possono così determinare attraverso lo studio dei fluidi
biologici (come plasma, urine, bile e liquido cefalo-rachidiano)
nuovi criteri che definiscono lo stato di salute e lo stato di
malattia sulla base di una valutazione integrata delle varianza
dei livelli dei metaboliti e dei parametri metabolici sistemici,
permettendo di definire lo stato fisio-patologico in termini sistemici
o organo specifico. In tale modo più che prendere in considerazione
uno o pochi metaboliti con i relativi processi metabolici, la
metabolomica esamina l’intero profilo metabolico determinato
dall’interconnessione dei diversi processi.
A tale scopo la spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare
e la Spettrometria di Massa, attraverso l’utilizzo metodi
di analisi matematiche multivariate rappresentano i mezzi più
potenti e più utilizzati per l’analisi del metaboloma,
permettendo insieme alla genomica funzionale ed alla proteomica
di aprire nuove strade conoscitive e applicative nel campo della
medicina, della farmacologia, della scienza dell’alimentazione
ed in generale delle biotecnologie.
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Fig.2
Spettro 1H RMN di un fluido biologico |
La risonanza magnetica nucleare
nella metabolomica.
Una delle tecniche sperimentali più adatte all’acquisizione
dei dati necessari per l’analisi metabolomica è la
spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) (1) .La spettroscopia
NMR multinucleare infatti permette di determinare su un singolo
campione centinaia di metaboliti, in maniera non distruttiva,
senza o con minimi pretrattamenti del campione stesso, e senza
una conoscenza a priori dei composti che devono essere determinati
(metaboliti).Per esempio, dall’acquisizione di spettri 1H
NMR di campioni biologici, come cellule o medium di coltura, estratti
tissutali o fluidi biologici di organismi viventi, è possibile
ottenere informazioni quali-quantitative relative a più
di 60 metaboliti contemporaneamente (fig.2).
Se l’analisi viene effettuata in funzione del tempo è
possibile valutare le direzioni delle variazioni osservate che
dipendono dalle perturbbazioni a cui sottoponiamo il sistema biologico
considerato. Applicando metodi chemiometrici e bioinformatici,
come analisi multivariata dei dati, è possibile valutare
in maniera integrata le variazioni specifiche osservate in termini
di cambiamenti e di correlazioni di variabili complesse che descrivono
l’effetto della perturbazione in quel sistema, mostrando
le loro interconnessioni e interdipendenze. Un altro importante
aspetto è la possibilità di determinare la distribuzione
isotopomerica di metaboliti intermedi in diversi pathways metabolici.
Utilizzando composti arricchiti con isotopi stabili (13C o 2H
), la spettroscopia NMR mono e bidimensionale permette la descrizione
della distribuzione degli atomi isotopi nello scheletro dei metaboliti
coinvolti nei flussi metabolici intra e inter-cellulare (fig.3).
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Fig.3
Esempio di produzione di isotopomeri 13C in epatociti
partendo da acido oleico arricchito uniformemente in 13C.
In verde sono indicati gli atomi dell'isotopo stabile (13C)
nei diversi intermedi metabolici. |
Metabolomica nella ricerca sul cancro.
Nel 1980, all’inizio dell’avvento delle basi molecolari
della medicina, si postulava che il cancro fosse causato dalla
mancata regolazione di alcuni oncogeni o geni soppressori.
L’identificazione di questi geni avrebbe quindi offerto
la possibilità di prevenire o curare il cancro. In seguito
apparve chiaro che i tumori sono molto più complessi ed
eterogenei di quanto si considerava e sono causati da modificazioni
di numerosi processi e di fattori che operano a diversi livelli.
I fattori che determinano effetti particolari o alterazioni di
un sistema biologico possono dipendere fortemente dal contesto
e sono regolati dall’attività di numerosi componenti
interagenti in funzione dello spazio e del tempo.
Ne deriva che oltre al rilevante interesse per la genomica per
comprendere il ruolo dei geni e dei loro prodotti quali le proteine,
sta crescendo l’interesse per definire e comprendere come
il metabolismo possa influenzare le reti genetiche e proteiche
di particolari fenotipi tumorali.
Come detto in precedenza, la gerarchia, derivante dalla biologia
molecolare, con una visione platonica top-down, in cui si ipotizza
un controllo dal genoma alla trascrittomica, alla proteomica ed
infine alla metabolomica, viene ad essere sostituita da una visione
bottom-up, con una struttura orizzontale dove l’aspetto
dominante relativo è dato dall’interazione con gli
altri componenti del sistema. Abbiamo inoltre precedentemente
visto che il metaboloma può essere definito come il profilo
quantitativo di tutte le molecole a basso peso molecolare presenti
in un sistema biologico in un particolare stato dinamico. Quantunque
è noto che le reti metaboliche variano nell’utilizzazione
dei substrati e nella distribuzione dei flussi, riflettendo la
funzione cellulare e il fenotipo, i loro nodi di controllo sono
stati ben conservati attraverso i processi evolutivi e rappresentano
punti determinanti per l’interazione con molecole farmacologicamente
attive (farmaci) considerando anche il numero limitato di isoforme
enzimatiche come pure di vie alternative per i processi metabolici,
che sono per lo più conosciute.
Che cosa distingue apparentemente la metabolomica dai precedenti
studi di metabolismo, è la sua focalizzazione su profili
metabolici completi e pathways associati di un campione piuttosto
che su uno o alcuni metaboliti. Questi profili sono rappresentati
da spettri NMR o di massa e sono comparati usando metodi di analisi
statistica multivariata dei dati che permettono di ottenere una
visione completa dei pathways molecolari all’interno del
sistema biologico studiato. Così mentre la genomica e la
trascrittomica danno un possibile funzionamento del sistema, la
metabolomica rappresenta il reale stato del sistema.
Tale metodica può fornire informazioni sullo stato attuale
del sistema biologico definendo il reale fenotipo. Le cellule
tumorali possiedono diversi meccanismi per iniziare e sostenere
i seguenti fenotipi: proliferativo, differenziato, trasformato,
arresto del ciclo cellulare, necrotico, apoptotico. Il comune
fenotipo di forme tumorali avanzate è caratterizzato da
elevata proliferazione, scarsa differenziazione, elevata trasformazione,
come pure resistenza a farmaci e apoptosi. Esse presentano anche
un elevato uptake del glucosio, che viene utilizzato come substrato
primario. Il processo di proliferazione è strettamente
associato con la sintesi de novo di macromolecole come RNA, DNA,
amminoacidi e acidi grassi prodotti da substrati a basso peso
molecolare come, glucosio, acidi grassi a corta catena e amminoacidi
attraverso complesse e interconnesse reti metaboliche.
Il cancro può essere visto come un sistema "robusto"
composto di cellule tumorali, la cui proliferazione è la
proprietà che necessita essere mantenuta nonostante le
condizioni del microambiente non siano del tutto favorevoli alla
crescita o le perturbazioni indotte da farmaci antitumorali la
inibiscano.
Quando si definisce la "robustezza" del cancro, la si
definisce in termini di sistema e non della singola cellula tumorale.
Infatti la robustezza del sistema tumorale è esplicata
dalla ridondanza funzionale generata dalla eterogenicità
cellulare nello stesso tumore e dai sistemi controllo feed-back
che operano nelle condizioni estreme (come ad esempio: ipossia
e farmaci antitumorali) (2). Un particolare tipo tumorale molte
volte risponde all’inibizione di uno specifico target, ma
è comune trovare che altri tipi di tumore non rispondono
a tale inibizione.
D’altra parte occorre considerare che la robustezza di un
sistema è sempre relativa, ed il sistema stesso si può
rivelare fragile di fronte a perturbazioni di diversa natura.
L’obiettivo da realizzare è quello di identificare
i diversi siti e le loro interrelazioni che determinano la fragilità
del sistema e trovare un metodo per indurla sistematicamente.
I fenotipi tumorali presentano differenze nel loro metaboloma.
Per esempio, cellule di tumore della mammella o terapia resistenti
presentano diversità nei processi metabolici rispetto a
cellule tumorali pancreatiche terapia-sensibili, e tale diversità
nel fenotipo metabolico si rifletta nella capacità di risposta
a farmaci pro-apoptotici. Le principali differenze sono state
individuate mediante l’analisi del profilo metabolico utilizzando
substrati arricchiti in 13C, nella velocità di sintesi,
di elongazione e desaturazione degli acidi grassi a lunga catena
in relazione alla diversa via metabolica utilizzata nel ciclo
dei pentoso.
Le cellule tumorali terapia-resistenti possiedono anche attività
di desaturazione di catene di acidi grassi, che comporta l’ulteriore
ossidazione del NADPH e permette al ramo ossidativo del ciclo
dei pentoso fosfati di operare per la sintesi di DNA anche sotto
trattamento di farmaci inibitori della via non ossidativa del
ciclo dei pentoso (3).
La metabolomica permette di correlare caratteristiche biologiche
e reti metaboliche, con l’obiettivo di determinare siti
multipli di controllo enzimatico all’interno di una rete
dovuti all’interconnessione delle reti metaboliche con pathways
di sintesi alternativi.
Basandosi su cose conosciute da diverso tempo, è possibile
ipotizzare che inibitori del ciclo dei pentoso fosfati possono
agire effettivamente su tumori che possiedonono una limitata sintesi
de novo di acidi grassi, mentre tumori che possiedono un elevata
velocità di turnover degli acidi grassi possono essere
trattati con un approccio combinato usando inibitori della acido
grasso sintasi, e elongasi e desaturasi, con farmaci convenzionali
che agiscono sul ciclo dei pentoso fosfati, produzione di acidi
nucleici dal backbone degli zuccheri, sintesi di RNA, replicazione
del DNA e conseguentemente proliferazione cellulare. Così
il profilo metabolico permette la scoperta di nuovi targets che
possano essere meno flessibili e meno variabili rispettoa targets
genetici e proteici.
Ricadute farmaceutiche
In ambito industriale, è importante segnalare la formazione
di un Consorzio tra università inglesi ed industrie farmaceutiche
multinazionali (progetto COMET, 2001) per la valutazione e validazione
della analisi metabolomica nella tossicologia dei farmaci, attraverso
la costituzione di banche-dati e sistemi esperti predittivi.
In particolare, gli obiettivi del progetto COMET sono quelli di
fornire una valutazione preclinica della tossicità e dei
potenziali effetti collaterali di farmaci in fase sperimentale,
in fase preclinica o negli stadi iniziali della fase sperimentale
clinica, che molte volte si sono rivelati di tale entità
da costringere le case farmaceutiche a ritirare i prodotti dal
mercato e a risponderne con risarcimenti economici cospicui.
Da notare che recentemente su Technology Revew del MIT di Boston
è riportata la metabolomica tra le dieci tecnologie emergenti
con un numero di pubblicazioni in tale settore su giornali scientifici
internazionali qualificati in crescita esponenziale tra il 2000
e il 2005.
I risultati a tutt’oggi ottenuti, oltre ad interessare il
settore industriale farmaceutico della tossicità dei farmaci,
stanno riguardanto la ricerca di nuovi indici metabolici integrati
per la diagnosi di patologie umane, come ad esempio: coronaropatie,
insulina resistenza, malattie degenerative del sistema nervoso
centrale.
Soprattutto si sta valutando l’effetto della dieta e della
flora batterica intestinale sullo stato di salute. A tale riguardo
presso i nostri laboratori si sta creando una banca dati basato
su spettri RMN 1H ottenuti su plasma di volontari sani e integrato
con dati clinici anamnestici e dati ematoclinici.
Tale banca dati, che ad oggi è costituita da 300 dati ottenuti
su 300 soggetti, è utilizzata in uno studio in corso sulle
variazioni metaboliche indotte dall’insufficienza renale
di severità variabile e dell’effetto della dialisi
e terapie integrative.
Futuro della Metabolomica
E’ facilmente prevedibile nei prossimi anni come l’approccio
metabolomico, insieme alla genetica funzionale ed alla proteomica
avrà un grosso impatto sia per quanto riguarda la ricerca
nell’Industria farmaceutica, nella diagnostica,nella terapeutica
e nell’ampio settore delle biotecnologie. In particolare
potrà essere applicabile per studi di tossicità
ed efficacia negli studi per lo sviluppo di farmaci nella fase
preclinica e clinica,nello screening e stadiazione di pazienti
con il potenziale di scoprire nuovi markers o insieme di markers
metabolici diagnostici.
Oltre a ridurre i tempi ed i costi per la ricerca e la sperimentazione
di nuovi farmaci la metabolomica insieme alla genetica funzionale
può dare indicazioni per farmaci già in produzione
la possibilità di impiego in terapia in nuove patologie
come pure riconsiderare farmaci i cui brevetti sono in scadenza.
Infine a tempi più lunghi potrà dare un contributo
fondamentale nell’ambito della prevenzione ma specie nella
personalizzazione delle terapie e dell’alimentazione ad
esse connesse.
Prof. Filippo Conti
Professor of Physical Chemistry
in Biotechnology Department of Chemistry,
”La Sapienza” University of Rome.
