L'attualità in tema di Legionella e legionellosi Breve storia dalla manifestazione alle più recenti acquisizioni.

Raffaele Peduzzi - Valeria Gaia - Loris Landi

Introduzione e cenno "storico" dell'insorgenza
La Legionella pneumophila è stata isolata per la prima volta, come agente batterico infettivo, in occasione di un'epidemia di polmoniti acute, insorte tra gli ex-combattenti che partecipavano al convegno dell'"American Legion" a Filadelfia nel luglio del 1976. La legionellosi porta anche il nome di "Morbo del legionario" proprio a causa di questa inattesa apparizione epidemica, dove furono constatati 149 casi di pneumopatie gravi e registrati 29 decessi in meno di quindici giorni. La fonte del contagio è risultata essere il sistema di climatizzazione dell'albergo dove avevano soggiornato i partecipanti, i quali si erano contaminati tramite l'inalazione di aerosol, costituiti d'acqua inquinata dal batterio. (Fig. 1) . La Legionella è rimasta nell'anonimato fino al 1976 a causa delle sue esigenze ecologiche particolari ed uniche nell'ambiente naturale, dove vive in simbiosi con dei protozoi nei biofilm. Si reputa che da sempre la Legionella sia stata presente nell'ambiente naturale; l'uomo coesisteva con la Legionella senza particolari inconvenienti. Solo recentemente, a causa del progresso tecnologico che le ha fornito i mezzi per "proliferare" e di trasmettersi sottoforma di aerosol all'uomo, il germe d'origine idrica ha potuto esprimere la sua patogenicità come conseguenza di un'amplificazione dell'interfaccia batterio-organismo umano dovuta alle nuove utilizzazioni dell'acqua. Citando Patrick Grimont dell'Institut Pasteur di Parigi "abbiamo dovuto attendere l'era delle climatizzazioni per costatare il potere patogeno della Legionella".

Fig.1 La prima insorgenza epidemica di Legionella è avvenuta in una situazione festosa dell'American Legion, analoga alla foto. In occasione di una riunione di ex-combattenti, il Congresso dell'American Legion in un albergo di Filadelfia nel luglio del 1976, si sono registrati 149 casi con 29 decessi.
La denominazione legionellosi o malattia del legionario è da far risalire a questa circostanza.

DEFINIZIONE
La legionellosi è stata definita una "polmonite di mezza stagione", presenta due manifestazioni distinte da un punto di vista clinico-epidemiologico: la malattia del legionario e la febbre di Pontiac. Entrambe sono caratterizzate all'esordio dalla perdita o diminuzione dell'appetito, malessere, cefalea, dolori muscolari. Entro 24-48 ore subentra una febbre elevata (39-40 °C) associata a brividi.È abbastanza frequente il riscontro di una tosse non produttiva, in molti pazienti si ha dolore addominale e diarrea.Inizialmente il quadro clinico simula la polmonite da micoplasmi, ma successivamente l'evoluzione è verso le più classiche polmoniti alveolari batteriche.

TERAPIA DELLA LEGIONELLOSI
- Essendo la Legionella un microorganismo intracellulare, unicamente gli antibiotici con una buona penetrazione intracellulare risultano efficaci.
- Tramite studi in vitro (colture cellulari) si è potuto provare che i macrolidi, i chinoloni, la rifampicina, le tetracicline e l'associazione di trimetoprim-sulfometoxazolo sono attivi.
- L'eritromicina è stata considerata per "lungo tempo" il trattamento elettivo, però ha dimostrato un potere battericida inferiore a quello delle nuove sostanze in uso. Inoltre, l'eritromicina è sovente all'origine di problemi d'intolleranza e d'interazioni medicamentose.
- Attualmente, nella pratica quotidiana si considerano nel trattamento di scelta i mocrolidi recenti, l'azitromicina, la claritromicina e i chinoloni (la ciprofloxacina oppure la levofloxacina).
Sotto trattamento, generalmente si costata un miglioramento dopo 3-5 giorni. La durata di trattamento preconizzata si situa tra 10 e 21 giorni (21 giorni in caso di immunodepressione).
- In caso d'infezioni gravi certi autori raccomandano l'associazione di due sostanze (macrolide + rifampicina oppure macrolide + chinolone). Va forse ribadito che, anche se i test in vitro possono indicare una sensibilità, le penicilline, le cefalosporine, l'imipeneme e gli aminoglicosidi non sono adeguati per il trattamento della legionellosi in quanto non hanno un'azione intracellulare.

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), la legionellosi è classificata tra le 30 nuove malattie infettive emerse in questi ultimi vent'anni, in un contesto evolutivo che è stato definito il "ritorno in forza" delle stesse malattie infettive. Nel riquadro abbiamo riportato, ripreso e modificato da Filice (1994), una definizione di polmonite da Legionella pneumophila e nella Fig. 2 un riassunto delle vie d'infezione che portano alla replicazione intracellulare nei microfagi polmonari e quindi alla legionellosi. (Steinert et al. 2001) Reputiamo pure utile riassumere in un riquadro alcune considerazioni sulla terapia prendendo lo spunto dal recente
documento "Legionella et légionellose" edito dall'Ufficio federale della salute pubblica di Berna (2005).

Fig.2 Vie d’infezione di legionella pneumophilia
Le vie di contaminazione dell'uomo partendo dall'elemento idrico: a) Nell'ambiente, Legionella è presente nei biofilm e si replica nei protozoi. b) Tramite un "vettore tecnico" Legionella colonizza le vie respiratorie umane. c) Dopo l'invasione dei macrofagi Legionella si replica nei vacuoli e causa la morte della cellula ospite provocandone la necrosi e l'apoptosi.

Le situazioni a rischio e la loro ripetitività
L'utilizzo dell'acqua per le diverse attività umane attuali e soprattutto nelle situazioni "distensive" (fontane decorative, vasche da "ribollizione", idromassaggi), di cura (terapie respiratorie, nebulizzatori non correttamente gestiti) e climatizzazione (torri di raffreddamento,
acque di condensazione, umidificatori), permette la diffusione di Legionella sottoforma di aerosol favorendo così la trasmissione all'uomo. Il serbatoio principale è l'acqua e non è conosciuta una trasmissione interumana (da persona a persona).
Nella tabella 1 e 2, sono riassunti i casi più interessanti d'insorgenze epidemiche di legionellosi con l'indicazione del luogo dove l'epidemia è insorta, la data, il numero di casi registrati e la causa. Epidemiologicamente constatiamo delle situazioni a rischio che hanno un denominatore comune nella loro ripetitività, come ad esempio l'insorgenza di legionellosi registrata in Olanda all'inizio del 1999: un aerosol prodotto durante un'esposizione floreale ha contaminato 226 persone, provocando 21 decessi. Una situazione analoga si era già prodotta nel 1990 in Louisiana, in un negozio di alimentari: un nebulizzatore che spruzzava dell'acqua sottoforma di aerosol sui prodotti esposti (nell'intento di tener freschi frutta e legumi) aveva provocato tra i clienti 32 casi di legionellosi, con 2 decessi confermati. Le epidemie di legionellosi sono difficili da identificare, e la fonte del contagio dev'essere localizzata rapidamente in modo da poter essere risanata. Da qui la necessità di raccomandazioni specifiche per la decontaminazione delle installazioni inquinate. Un'altra epidemia molto indicativa è quella insorta tra i pazienti dell'ospedale Pompidou di Parigi nel luglio del 2001 (12 casi con 6 morti). In questa infrastruttura sanitaria ultramoderna il circuito risultava contaminato dalla Legionella in quanto dalla messa in posa dell'installazione nuova all'apertura dell'ospedale erano trascorsi due anni. Il tempo necessario per la formazione di biofilm nella rete di distribuzione dell'acqua.
L'esame delle circostanze delle insorgenze epidemiche può risultare ricco di insegnamenti per evitare il ripetersi di errori nella gestione dell'acqua nelle abitazioni e le varie infrastrutture visitate dall'uomo. Ad esemon pio, secondo i dati riportati nella tabella inerenti le recenti epidemie si può constatare che le torri di raffreddamento sono risultate essere più volte la fonte dell'inquinamento da Legionella.
Nella prospettiva della prevenzione si reputa quindi che un'attenzione particolare debba essere dedicata a queste infrastrutture.

Tab. 1 e 2 Insorgenze epidemiche di legionellosi dal 1976 al 2001 e dal 2001 al 2004

Profilo batteriologico "identikit" della Legionella
Per comprendere la diffusione delle legionelle e le sue implicazioni epidemiologiche è necessario tracciare un profilo microbiologico e dare uno sguardo d'insieme all'habitat della famiglia delle Legionellaceae. Le legionelle sono piccoli bacilli Gram negativi (2-5 mm di lunghezza, 0.5 mm di larghezza), asporigeni, aerobi (Fig.3 Fig. 4 e Fig. 5). Delle 50 specie descritte, molte possiedono flagelli capaci di renderle mobili. La famiglia delle Legionellaceae comprende un solo genere Legionella. Attualmente le specie conosciute sono 50 e 71 sierogruppi sono stati determinati. A dipendenza delle regioni, tra il 70 ed il 90% dei casi di legionellosi sono dovuti a Legionella pneumophila sierogruppo 1.Ventuno altre specie risultano patogene per l'uomo, ma si presentano più raramente.
Le più conosciute sono (in ordine alfabetico): L. anisa, L. bozemanii, L. cincinnatiensis, L. dumoffii, L. feeleii, L. gormanii, L. jordanis, L. longbeachae, L. micdadei (Pittsburgh Pneumonia Agent), L. oakridgensis, L. parisiensis e L. tucsonensis. Nell'analisi batteriologica le difficoltà riscontrate per l'isolamento in coltura delle Legionella contrastano con la presenza ubiquitaria negli ambienti idrici poveri di nutrimento. In laboratorio questo batterio idrico con debole fabbisogno nutritivo ha un metabolismo inadatto ai terreni di coltura che risultano molto ricchi di materie nutritive.
Di conseguenza la maggior parte delle specie di Legionella non sono coltivabili su terreni normalmente utilizzati in batteriologia per gli altri germi infettivi. Alcune specie, messe in evidenza solo grazie alla loro associazione con le amebe per co-coltura, sono state denominate LLAP (Legionella-like amoebal pathogens). L'esame dei biofilm con l'epifluorescenza, l'amplificazione genica e l'immunofluorescenza diretta costituiscono i metodi più efficaci per la messa in evidenza, e forniscono di conseguenza un'attendibilità analitica maggiore dell'ubiquità della Legionella e del grado di contaminazione dell'acqua.

Fig.3 Colonie di Legionella pneumophila
Colonie di Legionella pneumophila. Coltura su piastra di Petri con terreno BCYE (estratto di lievito, cisteina).

Fig.4 Legionella pneumophila al microscopio. Immunofluorescenza

Fig.5 Legionella pneumophila al microscopio. Colorazione di Gram
Legionella pneumophila al microscopio. Colorazione di Gram; bacillo Gram negativo piccolo di 2-3 µm di lunghezza e 0,5 µm di larghezza.

Le esigenze ecologiche della Legionella
L'ecologia della Legionella è complessa ed il suo sviluppo nell'ambiente naturale dipende da diversi tipi di fattori, che vengono analizzati succintamente qui di seguito, indicandone le implicazioni.
Fattori fisici
La temperatura ottimale di crescita della Legionella è di 25°-45°C (quindi l'acqua tiepida favorisce la proliferazione del germe). La sua sopravvivenza comporta uno spettro termico molto vasto, può essere isolata dall'acqua tra 5,7 e 63°C. Soprattutto la sua resistenza oltre i 60°C, provoca molti inconvenienti derivanti dalla proliferazione nei circuiti di acqua calda e la conseguente contaminazione dell'uomo. Si noti che a queste temperature dell'acqua gli altri tipi di batteri generalmente soccombono. Viene così a cadere anche una competizione tra germi. La Legionella presenta una buona sopravvivenza in ambienti acidi ed alcalini: sopporta escursioni di valori di pH oscillanti tra 5,5 - 8,1. Bisogna pure sottolineare che la stagnazione dell'acqua e la sedimentazione favoriscono la crescita del germe. Le radiazioni ultraviolette (raggi UV) ne inibiscono lo sviluppo. Questa sensibilità permette di decontaminare ambienti fortemente inquinati dalla Legionella con gli UV.
Fattori chimici
Gli ioni d'Argento (Ag++) e Rame (Cu++) risultano inibitori, quindi, secondo alcuni autori, le tubature in rame inibiscono la colonizzazione. Per contro, i siliconi, il teflon, favoriscono l'adesione e il caucciù (giunti e ranelle) favoriscono uno sviluppo intenso. In genere, tutti i materiali che rilasciano in un ambiente liquido delle particelle organiche utilizzabili microbiologicamente favoriscono la colonizzazione da parte della Legionella (si pensi ai diversi
tipi di plastiche).
Fattori biologici
Nei biofilm le legionelle vivono in associazione con altri microorganismi che colonizzano le superfici. I biofilm ambientali sono composti da una comunità microbica ("consortium") complessa, composta da batteri aerobici e anaerobici, protozoi, nematodi, funghi (miceti) in una nicchia che ritiene i metaboliti (apporto di nutrienti: p.es. aminoacidi essenziali), inoltre attenua l'influenza delle variazioni fisico-chimiche (temperatura, ossigeno, biocidi). Ad esempio è stata constatata una sinergia di proliferazione con batteri del genere Pseudomonas, mentre esiste un antagonismo di crescita con il genere Aeromonas. Le legionelle possiedono l'importante caratteristica di sopravvivere e di moltiplicarsi in seno ai protozoi dell'ambiente naturale (amebe libere e ciliati), che possono servire sia come serbatoi, che da veicolo per l'infezione umana ed anche come protezione (grazie alle cisti molto resistenti).
Il grado di simbiosi è diverso a seconda della specie e del ceppo di Legionella (virulenti e non virulenti) ed a seconda delle specie di protozoi. (Harf C. Monteil H. 1988; Swanson M.S., Hammer B.K., 2000).

Le indagini microbiologiche ed epidemiologiche sulla Legionella
Quando viene identificato un caso di legionellosi si procede a dei prelievi ambientali alfine di localizzare la fonte così da delimitarne possibilmente l'epidemia. E' quindi importante poter stabilire quale dei serbatoi infettivi presi in considerazione sia quello realmente implicato nel contagio. L'indagine, effettuata allo scopo di evidenziare il germe, viene articolata in due comparti: il materiale clinico proveniente dal paziente e l'ambiente idrico. Infatti, le legionelle hanno potuto essere isolate da ambienti idrici quali corsi d'acqua, laghi, acque termali, bacini di accumulazione, pozzi, fontane estetiche, rubinetti, soffioni delle docce.

I casi
Grazie alle tecniche di biologia molecolare dette di fingerprinting è oggi possibile visualizzare su speciali filtri alcuni frammenti significativi del DNA degli organismi isolati dai campioni d'acqua. I profili che si ottengono corrispondono a delle vere e proprie impronte digitali.
Queste caratteristiche specifiche di ciascun microorganismo permettono di effettuare un confronto diretto fra ceppi batterici (Grimont et al., 1995). La tecnica impiegata permette di comparare tra loro alcune porzioni del DNA dei batteri in esame. (Gaia V. e Peduzzi R., 2002).
Il caso che abbiamo scelto quale esempio di approccio epidemiologico mediante metodologie genetiche, concerne un paziente affetto da legionellosi che aveva trascorso qualche settimana in uno stabilimento di cure termali.
Alla fine della cura si trasferì in Ticino nella sua casa di vacanza; la settimana seguente sviluppò una polmonite e venne ospedalizzato. Dall'aspirato bronchiale del paziente fu isolata in coltura una Legionella.
Vennero quindi prelevati dei campioni d'acqua nell'appartamento in Ticino e nell'ospedale, così come dell'acqua nello stabilimento termale e nell'albergo dove questi aveva soggiornato. I campioni d'acqua dell'appartamento del paziente e dell'ospedale si rivelarono negativi, mentre nell'acqua delle terme e dell'albergo è stato possibile mettere in evidenza la presenza di diversi ceppi di Legionella.
Si è potuto così stabilire che il paziente si era contaminato durante il soggiorno termale. Infatti, l'analisi tramite tipizzazione molecolare degli isolati ha permesso di evidenziare dei profili genetici identici per i ceppi prevenienti dall'acqua termale, dall'acqua dell'albergo e quello isolato sul paziente. Le tecniche basate sull'analisi genetica possono essere molto utili per le indagini epidemiologiche sulle vie di diffusione dei germi patogeni dall'ambiente idrico all'uomo e per il depistaggio dei germi patogeni.

La casistica e la sua evoluzione
Se prendiamo il dettaglio delle analisi cliniche richieste al CNR Legionella, vediamo che in pochi anni l'analisi tramite l'antigene si è imposta passando dal 30% del 1998 all'86% nel 2004. La diagnosi basata sull'antigene urinario pone dei limiti all'indagine epidemiologica in quanto non si dispone più del ceppo clinico di Legionella da poter comparare geneticamente con il ceppo ambientale. (Grafico 1). A livello di diagnosi sull'uomo bisogna pure annotare che l'antigene urinario facilita l'attività diagnostica, però se la documentazione del caso di legionellosi non è seguita dall'analisi per l'isolamento del germe sul paziente, non risulta possibile effettuare l'indagine epidemiologica allo scopo di definire l'origine del germe.
Quindi l'analisi dell'antigene urinario costituisce un vantaggio immediato per il paziente, ma non per l'indagine ambientale che prevede il raffronto del ceppo clinico con quello di origine ambientale. Incidenza della malattia del legionario in Europa per milioni di abitanti. Il "Gold Standard" è rappresentato dai 20 casi per milione della Danimarca. Secondo le dichiarazioni ufficiali del 2002-2003, possiamo osservare che la Svizzera con 23 casi per milioni di abitanti è leggermente al di sopra dello standard.
La Francia e l'Olanda hanno un'incidenza leggermente più bassa, mentre la Spagna dichiara 33,5 casi per milione di abitanti. L'Italia, sempre riferita all'anno 2002, dichiara 10,45 casi per milione di abitanti. La media europea si aggira su 8 casi/Mio di abitanti. (Grafico 2). L'evoluzione del numero di casi di Legionella in Svizzera dal 1995 al 2004 permette di constatare, dopo la veloce progressione degli ultimi anni del secolo, un andamento stazionario con tendenza alla diminuzione per il 2004. (Grafico 3). La curva valida per l'Europa presa come paragone ha un andamento analogo. Questa diminuzione è valida sia nei casi dovuti ai viaggi, che nei casi dichiarati. Le due curve tendono a diminuire a partire dal 2003. Comparando le cifre nazionali con il resto dell'Europa, otteniamo il prospetto seguente: il tasso medio d'infezione nei 24 paesi europei è di 3,9 casi per milione di abitanti. Nel 1997 con 1360 casi di legionellosi, il tasso di letalità è stato del 10%. La media svizzera è di 3,71 casi per milione di abitanti (solo per l'anno 1998: 10 casi / Mio abitanti).
Le fonti di contaminazione in Svizzera sono riportate nel Grafico 4. Sono dettagliati i casi dovuti a viaggi, i casi di origine nosocomiale e i casi di malattia contratta in ambienti comunitari. Le persone più frequentemente colpite risultano essere quelle con un'immunità diminuita, inoltre gli uomini a partire dai 50 anni presentano un rischio statistico maggiore in confronto al resto della popolazione.
Va comunque osservato che una terapia antibiotica adeguata mediante eritromicina o altri macrolidi, oppure composti appartenenti al gruppo dei chinoloni o delle tetracicline (vedi riquadro "Terapia della legionellosi") è nella maggior parte dei casi efficace.

Graf. 1 Analisi effettuate (in %) per la diagnosi della legionellosi dall'ICM e dal CNR Legionella tra il 1999 e il 2004
Tipo di analisi effettuate per la diagnosi della legionellosi dall'ICM e dal CNR Legionella tra il 1999 e il 2004.
Percentuali riferite a: antigene urinario, coltura batteriologica, sierologia.

Graf. 2 Incidenza della legionellosi in Europa nel 2002
Incidenza della legionellosi in Europa nel 2002. Dati riferiti a 15 nazioni.

Graf. 3 Numero di casi di legionellosi dichiarati in Svizzera
Numero di casi di legionellosi dichiarati in Svizzera dal 1995 al 2004.

Graf. 4 Numero di casi di legionellosi dichiarati in Svizzera
Numero di casi di legionellosi in Svizzera 2002-2003. Percentuali secondo le fonti di contaminazione.

Rischio e valori limite
A dipendenza dell'utilizzazione dell'acqua, la carica di legionelle può essere tollerata o inconciliabile. Ad esempio, secondo le nuove direttive svizzere, possiamo dedurre che dove il rischio è elevato, come ad esempio nei reparti di cure intensive, neonatologia o trapianti, già con 100 UFC/l (unità formanti colonie per litro) s'impongono delle misure correttive. Risulta quindi essenziale stabilire una correlazione tra l'utilizzo dell'acqua, presenza tollerata di legionelle, l'ambiente e la sensibilità dell'ospite soprattutto con riferimento all'immunocompetenza. Con un tentativo di modelizzazione semplice, mettendo sulle due assi cartesiane il grado di rischio e le concentrazioni di Legionella in UFC, è possibile localizzare le diverse infrastrutture dove l'acqua è utilizzata (Grafico 5).

Graf. 5 Correlazione tra utilizzo dell’acqua e presenza tollerata di Legionelle
Correlazione tra utilizzo dell'acqua e presenza tollerata di Legionelle (unità formanti colonie UFC e livello di rischio).


Appare chiaramente nei due estremi che con una bassa concentrazione di legionelle il rischio è elevato per i reparti ospedalieri citati (cure intensive, trapianti, ecc.), mentre per torri di raffreddamento e uffici amministrativi e commerciali il rischio è limitato pur registrando una forte concentrazione di legionelle. Mediante un caso pratico da noi registrato possiamo illustrare questa problematica: un paziente uscito dalle cure intense faceva registrare una recidiva di legionellosi rientrando al proprio domicilio dove il tasso di legionelle nell'acqua era alto (Fig. 6).
In un primo tempo sotto accusa era l'infrastruttura ospedaliera, ma in questo caso era l'acqua potabile al rubinetto che rappresentava un rischio elevato a causa dello stato immunitario compromesso del paziente. Infatti, mediante la tipizzazione molecolare dei ceppi, abbiamo potuto provare che il paziente si era contaminato nella sua abitazione.

Fig.6 Legionellosi recidiva in un paziente con trapianto renale
Legionellosi recidiva in un paziente con trapianto renale. La fonte del contagio della recidiva era l'acqua
dell'abitazione.

Conclusioni
In conclusione possiamo evidenziare i punti seguenti:
- I problemi legati alla gestione dell'acqua non sono mai risolti definitivamente, anche nei paesi industrializzati con igiene avanzata. La contaminazione dell'acqua da germi dei quali s'ignorava persino l'esistenza, come nel caso della Legionella (sconosciuta fino al 1976) e le nuove utilizzazioni (climatizzazioni) amplificano il ruolo dell'acqua nella diffusione di patogeni emergenti.
- La conoscenza dei bisogni e delle esigenze ecologiche della Legionella permette di meglio lottare contro la sua proliferazione. La diagnosi di legionellosi deve essere associata alla ricerca di Legionella nell'ambiente idrico (fonte principale delle infezioni) per poter eliminare il focolaio contaminante
- I nuovi approcci analitici dei quali disponiamo attualmente, soprattutto basati su metodi di biologia molecolare, permettono di lottare in modo efficace contro l'insorgenza epidemica della legionellosi.
- La preponderanza diagnostica mediante l'antigene urinario ha come conseguenza una riduzione delle analisi di coltura e quindi dell'isolamento dei ceppi batterici responsabili, impedendo quindi di risalire mediante tipizzazione alla fonte d'infezione. Questo inconveniente può essere aggirato mediante il perfezionamento delle nuove tecniche di tipizzazione molecolari, grazie alle quali la caratterizzazione del ceppo potrà essere eseguita direttamente dal campione clinico e quindi senza passare attraverso la coltura.
- La fonte inquinante in ogni modo va ricercata, controllata e decontaminata. Si può evocare anche la malattia del legionario come malattia professionale per certe professioni dove sono prodotti degli aerosol sul luogo di lavoro. Infatti, dopo la diagnosi, la prima domanda posta al paziente tramite un questionario riguarda l'ambiente di lavoro.


Raffaele Peduzzi

Professor of Microbiology,
University of Geneva Switzerland.
Director of the Cantonal Bacteriological Institute
Bellinzona - Canton Ticino - Switzerland.
Valeria Gaia
Centro Nazionale di Referenza per Legionella, Bellinzona
Loris Landi
Dirigente medico A.S.L. Napoli 5, Ercolano